FLT3的嵌合受体及其使用方法与流程

急性髓系白血病(aml)是一种异质性血液学恶性肿瘤，其是成人中诊断的最常见的急性白血病类型。aml占所有白血病的大致三分之一，在2013年仅在美国已报导经估计的14,500例新病例，且总体存活率差。过去三十年里，aml患者的护理标准几乎没有改善。然而，分子及细胞生物的最近进展已经彻底改变我们对正常和患病状态下的人造血作用的理解。

已鉴别出涉及疾病发病机制的若干关键参与者，且其可作为可执行(actionable)目标来探查。在大约30％aml中最常突变的一种此类活化“驱动子”基因是flt3。

也称为胎肝激酶2(flk-2)、人干细胞激酶1(sck-1)或分化抗原群(cd135)的fms样酪氨酸激酶3(flt3)是一种造血受体酪氨酸激酶，其在20世纪90年代由两个独立的小组克隆。位于人染色体13q12上的flt3基因编码iii类受体酪氨酸激酶蛋白，其与其他iii类家族成员共享同源性，所述其他iii类家族成员包括干细胞因子受体(c-kit)、巨噬细胞集落刺激因子受体(fms)和血小板衍生生长因子受体(pdgfr)。

当与flt3配体结合时，flt3受体经历同源二聚化，从而实现近膜域中特异性酪氨酸残基的自磷酸化，及经由pi3k/akt、mapk和stat5途径的下游活化。因此，flt3在控制正常造血细胞的增殖、存活和分化中起关键作用。

人flt3在cd34+cd38-造血干细胞(hsc)以及树突状前体细胞的亚组中表达。flt3表达也可在多能祖细胞中检测到，多能祖细胞如cd34⁺cd38⁺cd45ra^-cd123^低共同髓系祖细胞(cmp)、cd34⁺cd38⁺cd45ra⁺cd123^低粒细胞单核细胞祖细胞(gmp)和cd34⁺cd38⁺cd10⁺cd19^-共同淋巴样祖细胞(clp)。有趣的是，在cd34⁺cd38^-cd45ra^-cd123^-巨核细胞红细胞祖细胞(mep)中几乎不存在flt3表达。因此，flt3表达主要限于早期髓系及淋巴样祖细胞，其中一些表达在较成熟的单核细胞谱系细胞中。flt3的这种有限的表达模式与flt3配体的表达模式形成鲜明对比，所述flt3配体在大多数造血组织以及前列腺、肾、肺、结肠和心脏中表达。这些不同的表达模式，使得flt3表达是确定flt3信号传送途径的组织特异性的速率限制步骤。

aml中最常见的flt3突变是flt3内部串联重复(flt3-itd)，其见于20％至38％患有细胞遗传学正常aml的患者中。flt3-itd当近膜域编码序列的一部分经复制且以头接尾取向插入时形成。在患有慢性淋巴性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤的患者中尚未鉴别出表明对aml的强烈疾病特异性的flt3突变。突变体flt3活化通常跨所有fab亚型观察到，然而，其在患有fabm5(单核细胞白血病)的aml患者中显著增加，而fab亚型m2及m6(粒细胞性或红白血病)显著地不太频繁地与flt3活化相关，符合flt3的正常表达模式。小百分比的aml患者(5％至7％)在flt3酪氨酸激酶域(flt3tkd)中呈现有单个氨基酸突变，最常见在d835处，或在一些情况下在t842或i836处，同时甚至较少患者(约1％)在涉及残基579、590、591和594的flt3近膜域中具有突变。具有flt3-itd突变体aml的患者具有特性在于早期复发及存活差的侵袭性形式的疾病，而总体存活和无事件存活不受flt3-tkd突变的存在的显著影响。此外，与具有野生型tet2或dnmt3a的flt3-itd突变体aml患者相比，并行tet2或dnmt3a突变的具有flt3-itd突变的aml患者具有不利的总体风险特征，其强调aml的临床及生物异质性。

flt3-itd及flt3tkd突变均诱导flt3的配体非依赖性活化，其导致ras/mapk途径及pi3k/akt途径的下游活化。然而，与任一突变相关的下游信号传送途径的主要区别在于stat5由flt3-itd优先活化，从而引起增殖潜力增加及dna修复途径的调节异常。

与flt3突变状态无关，flt3磷酸化在超过三分之二的aml患者中是明显的，且flt3在>80％aml母细胞中表达，且在约90％的所有aml患者中表达，使其成为以大样品大小的形式的疾病发病机制相关的有吸引力的治疗靶标。

若干小分子抑制剂已呈针对具有flt3突变的aml患者的有吸引力的治疗选项出现。第一代flt3酪氨酸激酶抑制剂(tki)的特性在于缺乏选择性、效力和不利的药物动力学性质。已开发较新且更具选择性的药剂来应对这种问题；然而，其功效受出现继发性耐药(secondaryresistance)的限制。

若干早期flt3tki包括米哚妥林(midostaurin)(pkc412)、来他替尼(lestaurtinib)(cep-701)、舒尼替尼(sunitinib)(sui1248)和索拉非尼(sorafinib)(bay43-9006)等。在患有复发性或难治性aml的患者中，在所述多激酶靶向药剂的情况下i期及ii期的反应速率是有限，大概归因于其不能在没有剂量限制性毒性的情况下达成有效的flt3抑制。奎扎替尼(quizartinib)(ac220)已开发为对flt3野生型和flt3-itd具有高选择性的第二代flt3tki，且已经证实特别在较年轻患者群体中的围移植设定(peritransplantsetting)方面的益处。然而，在接受奎扎替尼的复发性患者中鉴别的flt3的继发性突变强调开发针对aml患者的更好的治疗策略的需要，同时突出flt3作为治疗靶目标正确性。

若干靶向药剂已在患有原发性(denovo)、复发性/难治性或继发性疾病的aml患者中经测试。肿瘤抑制基因的表观遗传沉默在aml疾病发病机制中起重要作用，且dna甲基转移酶(dnmt)抑制剂(如阿扎胞苷(azacitadine)及地西他滨)已经取得一些临床成功。此外，影响aml患者亚组中的组蛋白翻译后修饰(例如，ezh2及asxl1突变)或dna甲基化(例如，dnmt3a、tet2、idh1/2)的突变的最近鉴别已引起多种治疗选项的发展，治疗选项包括ezh2、dot1l、idh1/2抑制剂，连同hdac与蛋白酶体抑制剂。然而，所述化合物中的许多在aml细胞中的临床前研究表明，这些抑制剂可能改变造血分化的表型及基因表达特性，而非造成aml母细胞的直接细胞毒性。因此，仍然有鉴别出新颖的靶标/模态以应对aml并造成aml母细胞的靶向溶解的强烈的、未满足的医疗需要。针对aml的其他治疗候选者包括aurora激酶抑制剂(包括amg900)及在细胞周期进程中起重要作用的polo样激酶的抑制剂。

当可行时，针对aml患者的护理标准仍然是化学疗法与干细胞移植。然而，大多数经治疗的患者中复发性/难治性病例的出现准许另外的治疗模态。若干白血病特异性抗原的鉴别及描述、连同免疫介导的移植物抗白血病效应的更明确的理解已为开发用于应对血液学恶性肿瘤的免疫调节策略做好准备，其综述于若干文章中。

经工程改造的免疫细胞已显示在治疗性治疗中(特别是在肿瘤学中)具有所要的质量。两种主要类型的经工程改造的免疫细胞是含有嵌合抗原受体(称为“car”或“car-t”)及t细胞受体(“tcr”)的免疫细胞。所述经工程改造的细胞经工程改造以赋予其抗原特异性，同时保留或增强其识别并杀伤靶细胞的能力。嵌合抗原受体可包含例如：(i)抗原特异性组分(“抗原结合分子”)；(ii)一个或多个共刺激域；和(iii)一个或多个活化域。各域均可以是异质性的，即，包含来源于不同蛋白质链的序列。嵌合抗原受体表达免疫细胞(诸如t细胞)可用于各种疗法，包括癌症疗法。应当理解，如本文所定义的共刺激多肽可用于增强针对靶抗原的car表达细胞的活化，且因此增加过继性免疫疗法的效力。

t细胞可以经工程改造以具有对一个或多个所要靶目标的特异性。例如，t细胞可用编码抗原结合分子(诸如抗体的一个或多个单链可变片段(“scfv”))的dna或其他遗传物质结合一个或多个信号传送分子和/或一个或多个活化域(诸如cd3ζ)转导。

除了car-t细胞的识别并破坏经靶向的细胞的能力之外，成功的t细胞疗法受益于car-t细胞的以下能力：持续且维持响应于抗原而增殖的能力。

t细胞受体(tcr)是见于t细胞表面上的分子，其负责识别作为结合至主要组织相容性复合体(mhc)分子的肽的抗原片段。tcr包含两种不同的蛋白质链(在大约95％的人tcr中)，tcr由阿尔法(α)及贝塔(β)链组成。在大约5％的人t细胞中，tcr由γ及δ(γ/δ)链组成。各链均包含两个细胞外域：可变(v)区及恒定(c)区，两者均属于免疫球蛋白超家族。如在其他免疫球蛋白中一样，tcrα链及β链(或γ及δ(γ/δ)链)的可变域各自具有三个高变区或互补决定区(cdr)。当tcr与抗原肽及mhc(肽/mhc)接合时，t细胞变得活化，使其能够攻击并破坏靶细胞。

然而，当前疗法已显示伴随非所要的副作用的程度不同的有效性。因此，存在鉴别用于治疗flt3相关疾病及病症的新颖的且改善的疗法的需要。

技术实现要素：

本发明涉及对flt3具有特异性的经工程改造的免疫细胞(诸如car或tcr)、抗原结合分子(包括但不限于抗体、scfv、重链和/或轻链和这些抗原结合分子的cdr)。

本发明进一步涉及一种新颖的cd28序列，其可用作这些细胞中的共刺激域。

本发明的嵌合抗原受体通常包含：(i)flt3特异性抗原结合分子；(ii)一个或多个共刺激域；和(iii)一个或多个活化域。应当理解，各域均可以是异质性的，因此包含来源于不同蛋白质链的序列。

在一些实施方案中，本发明涉及一种嵌合抗原受体，其包含特异性结合至flt3的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含以下项中的至少一者：(a)可变重链cdr1，其包含与seqidno:17的氨基酸序列相差不多于3、2、1或0个氨基酸残基的氨基酸序列；(b)可变重链cdr2，其包含与seqidno:18或seqidno:26的氨基酸序列相差不多于3、2、1或0个氨基酸残基的氨基酸序列；(c)可变重链cdr3，其包含与seqidnoseqidno:19或seqidno:27的氨基酸序列相差不多于3、2、1或0个氨基酸残基的氨基酸序列；(d)可变轻链cdr1，其包含与seqidno:22或seqidno:30的氨基酸序列相差不多于3、2、1或0个氨基酸残基的氨基酸序列；(e)可变轻链cdr2，其包含与seqidno:23或31的氨基酸序列相差不多于3、2、1或0个氨基酸残基的氨基酸序列；(f)可变轻链cdr3，其包含与seqid:24或seqidno:32的氨基酸序列相差不多于3、2、1或0个氨基酸残基的氨基酸序列。

在其他实施方案中，嵌合抗原受体还包含至少一个共刺激域。在进一步实施方案中，嵌合抗原受体还包含至少一个活化域。

在某些实施方案中，共刺激域是以下项的信号传送区：cd28、cd28t、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、可诱导型t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cdl-la/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdlld、itgae、cd103、itgal、cdlla、lfa-1、itgam、cdllb、itgax、cdllc、itgbl、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、与cd83特异性结合的配体或其任何组合。

在一些实施方案中，共刺激域来源于4-1bb。在其他实施方案中，共刺激域来源于ox40。也参见，hombach等人,oncoimmunology.2012年7月1日；1(4):458–466。在又其他实施方案中，共刺激域包含如guedan等人,2014年8月14日；blood:124(7)及shen等人,journalofhematology&oncology(2013)6:33中所述的icos。在又其他实施方案中，共刺激域包含如song等人,oncoimmunology.2012年7月1日；1(4):547–549中所述的cd27。

在某些实施方案中，cd28共刺激域包含seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6或seqidno:8。在另外的实施方案中，cd8共刺激域包含seqidno:14。在进一步实施方案中，活化域包含cd3、cd3ζ或具有seqidno:10中所阐明的序列的cd3ζ。

在其他实施方案中，本发明涉及一种嵌合抗原受体，其中共刺激域包含seqidno:2且活化域包含seqidno:10。

本发明进一步涉及编码嵌合抗原受体的多核苷酸及包含所述多核苷酸的载体。所述载体可以是例如逆转录病毒载体、dna载体、质粒、rna载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。本发明进一步涉及包含所述载体的免疫细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体是pgar载体。

示范性免疫细胞包括但不限于t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、nk细胞、tcr表达细胞、树突状细胞或nk-t细胞。t细胞可以是自体的、同种异体的或异源的。在其他实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本文所述的免疫细胞。

在某些实施方案中，本发明涉及抗原结合分子(及包含这些分子的嵌合抗原受体)，其包含以下项中的至少一者：

(a)与10e3的vh区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vh区及与10e3的vl区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vl区；

(b)与2e7的vh区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vh区及与2e7的vl区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vl区；

(c)与8b5的vh区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vh区及与8b5的vl区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vl区；

(d)与4e9的vh区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vh区及与4e9的vl区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vl区；和

(e)与11f11的vh区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vh区及与10e3的vl区的氨基酸序列相差不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸残基的vl区；

且其中该(或这些)vh区及vl区由至少一个连接子连接。

在其他实施方案中，本发明涉及抗原结合分子(及包含这些分子的嵌合抗原受体)，其中连接子包含scfvg4s连接子及scfvwhitlow连接子中的至少一者。

在其他实施方案中，本发明涉及编码本发明的多肽的载体，且涉及包含这些多肽的免疫细胞。优选的免疫细胞包括t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、nk细胞、tcr表达细胞、树突状细胞或nk-t细胞。t细胞可以是自体的、同种异体的或异源的。

在其他实施方案中，本发明涉及经分离的多核苷酸，其编码包含特异性结合至flt3的抗原结合分子的嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中所述抗原结合分子包含可变重(vh)链cdr3，所述可变重(vh)链cdr3包含seqidno:19或seqidno:27的氨基酸序列。所述多核苷酸可还包含活化域。在优选实施方案中，活化域是cd3、更优选cd3ζ、更优选seqidno:9中所阐明的氨基酸序列。

在其他实施方案中，本发明包括共刺激域，诸如cd28、cd28t、ox40、4-1bb/cd137、cd2、cd3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、cd4、cd5、cd7、cd9、cd16、cd22、cd27、cd30、cd33、cd37、cd40、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1(cdlla/cd18)、cd247、cd276(b7-h3)、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhci类分子、tnf、tnfr、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdl-ld、itgae、cd103、itgal、cdl-la、lfa-1、itgam、cdl-lb、itgax、cdl-lc、itgbl、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、cd83配体或其片段或组合。下文叙述优选共刺激域。

在进一步实施方案中，本发明涉及编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的经分离的多核苷酸，其中所述car或tcr包含特异性结合至flt3的抗原结合分子，且其中所述抗原结合分子包含可变轻(vl)链cdr3，所述可变轻(vl)链cdr3包含选自seqidno:24及seqidno:32的氨基酸序列。多核苷酸可还包含活化域。多核苷酸可还包含共刺激域。

在其他实施方案中，本发明涉及经分离的多核苷酸，其编码包含特异性结合至flt3的抗原结合分子的嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中所述抗原结合分子重链包含cdr1(seqidno:17)、cdr2(seqidno:18)和cdr3(seqidno:19)，且所述抗原结合分子轻链包含cdr1(seqidno:22)、cdr2(seqidno:23)和cdr3(seqidno:24)。

在其他实施方案中，本发明涉及经分离多核苷酸，其编码包含特异性结合至flt3的抗原结合分子的嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其中所述抗原结合分子重链包含cdr1(seqidno:17)、cdr2(seqidno:26)及cdr3(seqidno:27)，且所述抗原结合分子轻链包含cdr1(seqidno:30)、cdr2(seqidno:31)及cdr3(seqidno:32)。

本发明进一步涉及flt3的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含如本文所阐明的至少一个可变重链cdr3或可变轻链cdr3序列。本发明进一步涉及flt3的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含如本文所述的至少一个可变重链cdr1、cdr2和cdr3序列。本发明进一步涉及flt3的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含如本文所述的至少一个可变轻链cdr1、cdr2和cdr3序列。本发明进一步涉及flt3的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含如本文所述的可变重链cdr1、cdr2、cdr3、以及可变轻链cdr1、cdr2和cdr3序列两者。

适用于根据本发明的flt3结合分子的另外重链可变域及轻链可变域以及cdr多核苷酸及氨基酸序列是见于2015年7月31日提交的美国临时申请第62/199,944号中。

本发明进一步涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的抗原结合分子、car、tcr、多核苷酸、载体、细胞或组合物。合适于治疗的疾病包括但不限于急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、慢性粒单核细胞白血病(cmml)、幼年型粒单核细胞白血病、非典型慢性髓系白血病、急性早幼粒细胞白血病(apl)、急性单核细胞白血病、急性红白血病、急性巨核细胞白血病、骨髓增生异常综合征(mds)、骨髓增生性病症、髓系赘生物、髓系肉瘤或其组合。另外的疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、过敏、气喘、克罗恩氏病、ibd、ibs、纤维肌痛(fibromyalga)、肥大细胞增多症(mastocytosis)和乳糜泻。

附图说明

图1绘示对人细胞系上的flt3细胞表面表达的流式细胞术分析。

图2绘示用编码各种car的mrna电穿孔的原代人t细胞中的car表达。

图3绘示共培养16小时后经电穿孔的cart细胞相对于多种细胞系的溶细胞活性。

图4(包含图3a及图3b)绘示与所指示的靶细胞系共培养16小时后经电穿孔的cart细胞的ifnγ、il-2和tnfα产生。

图5绘示来自两个健康供体的经慢病毒转导的原代人t细胞中的car表达。

图6绘示来自两个健康供体的随时间推移的平均溶细胞活性，所述两个健康供体表达与各种靶细胞系共培养的所指示的car。

图7(包含图7a、图7b和图7c)绘示与所指示的靶细胞系共培养16小时后来自两个健康供体的经慢病毒转导的cart细胞的ifnγ、tnfα和il-2产生。

图8绘示与cd3-cd28珠粒或所指示的靶细胞系共培养5天后来自两个健康供体的经cfse标记的慢病毒转导的cart细胞的增殖。

图9绘示用于体内研究的经慢病毒转导的原代人t细胞中的car表达。

图10绘示将cart细胞静脉内注射于异种模型中后经标记的急性髓系白血病细胞的生物发光成像。

图11绘示注射cart细胞的小鼠的存活曲线。

图12绘示pgar载体图。

具体实施方式

应当理解，嵌合抗原受体(car或car-t)及t细胞受体(tcr)是经遗传工程改造的受体。所述经工程改造的受体可根据所属领域中已知的技术容易地插入到免疫细胞(包括t细胞)中，且由其表达。在car的情况下，单个受体可经编程以识别特异性抗原，并且当结合至所述抗原时活化免疫细胞以攻击且破坏携带所述抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达car的免疫细胞可靶向且杀伤肿瘤细胞。

car可通过并入与所靶向的抗原相互作用的抗原结合分子来工程改造以结合至所述抗原(诸如细胞表面抗原)。优选的是，抗原结合分子是其抗体片段，且更优选的是一个或多个单链抗体片段(“scfv”)。scfv是具有抗体的连接在一起的重链与轻链的可变区的单链抗体片段。参见，美国专利第7,741,465号及第6,319,494号以及eshhar等人,cancerimmunolimmunotherapy(1997)45:131-136。scfv保留亲本抗体与靶抗原特异性相互作用的能力。scfv优选用于嵌合抗原受体，因为它们可以经工程改造以连同其他car组分一起表达为单链的一部分。同上。也参见，krause等人,j.exp.med.,第188卷,第4期,1998(619–626)；finney等人,journalofimmunology,1998,161:2791–2797。应当理解，抗原结合分子通常容纳于car的细胞外部分内，使得其能够识别并结合至所关注的抗原。双特异性car及多特异性car考虑在本发明范围内，其对多于一个所关注的靶标具有特异性。

共刺激域。嵌合抗原受体可并入共刺激(信号传送)域以增加其效力。参见，美国专利第7,741,465号及第6,319,494号，以及krause等人及finney等人(见上文)；song等人,blood119:696-706(2012)；kalos等人,scitransl.med.3:95(2011)；porter等人,n.engl.j.med.365:725-33(2011)；和gross等人,annu.rev.pharmacol.toxicol.56:59–83(2016)。例如，cd28是在t细胞上天然发现的共刺激蛋白。cd28的完整天然氨基酸序列描述于ncbi参考序列：np_006130.1中。完整天然cd28核酸序列描述于ncbi参考序列：nm_006139.1中。

某些cd28域已用于嵌合抗原受体中。根据本发明，已经发现，当用于car构建体时，新颖的cd28细胞外域(称为“cd28t”)意外地提供某些益处。

cd28t分子(包括细胞外cd28t域及cd28跨膜域与细胞内域)的核苷酸序列阐明于seqidno:1中：

cttgataatgaaaagtcaaacggaacaatcattcacgtgaagggcaagcacctctgtccgtcacccttgttccctggtccatccaagccattctgggtgttggtcgtagtgggtggagtcctcgcttgttactctctgctcgtcaccgtggcttttataatcttctgggttagatccaaaagaagccgcctgctccatagcgattacatgaatatgactccacgccgccctggccccacaaggaaacactaccagccttacgcaccacctagagatttcgctgcctatcggagc

对应氨基酸序列阐明于seqidno:2中：

ldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

cd28t的细胞外部分的核苷酸序列阐明于seqidno:3中：

cttgataatgaaaagtcaaacggaacaatcattcacgtgaagggcaagcacctctgtccgtcacccttgttccctggtccatccaagcca

cd28t细胞外域的对应氨基酸序列阐明于seqidno:4中：ldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp

cd28跨膜域的核苷酸序列阐明于seqidno:5中：

ttctgggtgttggtcgtagtgggtggagtcctcgcttgttactctctgctcgtcaccgtggcttttataatcttctgggtt

cd28跨膜域的氨基酸序列阐明于

seqidno:6中：fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv

cd28细胞内信号传送域的核苷酸序列阐明于seqidno:7中：

agatccaaaagaagccgcctgctccatagcgattacatgaatatgactccacgccgccctggccccacaaggaaacactaccagccttacgcaccacctagagatttcgctgcctatcggagc

cd28细胞内信号传送域的氨基酸序列阐明于seqidno:8中：rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

合适用于本发明的另外的cd28序列包括seqidno:11中所阐明的cd28核苷酸序列：

attgaggtgatgtatccaccgccttacctggataacgaaaagagtaacggtaccatcattcacgtgaaaggtaaacacctgtgtccttctcccctcttccccgggccatcaaagccc

对应氨基酸序列阐明于seqidno:12中：

ievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp

其他合适的细胞外序列或跨膜序列可来源于cd8。合适的cd8细胞外域和跨膜域的核苷酸序列阐明于seqidno:13中：

gctgcagcattgagcaactcaataatgtattttagtcactttgtaccagtgttcttgccggctaagcctactaccacacccgctccacggccacctaccccagctcctaccatcgcttcacagcctctgtccctgcgcccagaggcttgccgaccggccgcagggggcgctgttcataccagaggactggatttcgcctgcgatatctatatctgggcacccctggccggaacctgcggcgtactcctgctgtccctggtcatcacgctctattgtaatcacaggaac

对应氨基酸序列阐明于seqidno:14中：

aaalsnsimyfshfvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrn

除了其他来源的外，本发明范围内的合适的共刺激域可来源于cd28、cd28t、ox40、4-1bb/cd137、cd2、cd3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、cd4、cd5、cd7、cd9、cd16、cd22、cd27、cd30、cd33、cd37、cd40、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1(cdlla/cd18)、cd247、cd276(b7-h3)、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhci类分子、tnf、tnfr、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdl-ld、itgae、cd103、itgal、cdl-la、lfa-1、itgam、cdl-lb、itgax、cdl-lc、itgbl、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、cd83配体或其片段或组合。

活化域。

cd3是天然t细胞上t细胞受体的元件，且已经显示是car中重要的细胞内活化元件。在优选实施方案中，cd3是cd3ζ，其核苷酸序列阐明于seqidno:9中：

agggtgaagttttccagatctgcagatgcaccagcgtatcagcagggccagaaccaactgtataacgagctcaacctgggacgcagggaagagtatgacgttttggacaagcgcagaggacgggaccctgagatgggtggcaaaccaagacgaaaaaacccccaggagggtctctataatgagctgcagaaggataagatggctgaagcctattctgaaataggcatgaaaggagagcggagaaggggaaaagggcacgacggtttgtaccagggactcagcactgctacgaaggatacttatgacgctctccacatgcaagccctgccacctagg

细胞内cd3ζ的对应氨基酸阐明于seqidno:10中：

rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpr

rknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

域取向

在结构上，应当理解，这些域对应于相对于免疫细胞的位置。因此，这些域可以是以下的一部分：(i)“铰链”域或胞外(ec)域(ec)；(ii)跨膜(tm)域；和/或(iii)细胞内(细胞质)域(ic)。细胞内组分经常部分包含cd3家族的成员，优选cd3ζ，其能够在抗原结合分子结合至其靶标时活化t细胞。在一个实施方案中，铰链域通常包含如本文所定义的至少一个共刺激域。

也应当理解，铰链区也可含有免疫球蛋白家族成员(诸如igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igd、ige、igm)中的一些或全部或其片段。

根据本发明的示范性car构建体阐明于表1中。

表1

相对于细胞的域

应当理解，相对于携带受体的细胞，本发明的经工程改造的t细胞包含抗原结合分子(诸如scfv)、细胞外域(其可包含“铰链”域)、跨膜域和细胞内域。细胞内域至少部分包含活化域，优选包含cd3家族成员诸如cd3ζ、cd3ε、cd3γ或其部分。应当进一步理解，抗原结合分子(例如，一种或多种scfv)经工程改造，使得其位于分子/构建体的细胞外部分，使得其能够识别并结合至其一个或多个靶标。

细胞外域。细胞外域对于信号传送且对于淋巴细胞对抗原的有效反应是有利的。特别用于本发明的细胞外域可来源于(即，包含)cd28、cd28t、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、可诱导型t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cdl-la/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdlld、itgae、cd103、itgal、cdlla、lfa-1、itgam、cdllb、itgax、cdllc、itgbl、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、与cd83特异性结合的配体或其任何组合。细胞外域可来源于天然来源或合成来源。

如本文所述，细胞外域常常包含铰链部分。这是细胞外域的一部分，有时称为“间隔”区。可根据本发明采用多种铰链，包括如上文所述的共刺激分子，以及免疫球蛋白(ig)序列或其他合适的分子，以达成与靶细胞相距所要的特殊距离。在一些实施方案中，整个细胞外区包含铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含cd28t或cd28的ec域。

跨膜域。car可设计成包含融合至car的细胞外域的跨膜域。其可类似地融合至car的细胞内域。在一个实施方案中，使用与car中的域的一者天然缔合的跨膜域。在一些情况下，跨膜域可通过氨基酸取代经选择或修饰，以避免此类域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜域，以使与受体复合体的其他成员的相互作用最小。跨膜域可来源于天然来源或合成来源。当来源是天然的时，所述域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。特别用于本发明的跨膜区可来源于(即，包含)cd28、cd28t、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、可诱导型t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cdl-la/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdlld、itgae、cd103、itgal、cdlla、lfa-1、itgam、cdllb、itgax、cdllc、itgbl、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、与cd83特异性结合的配体或其任何组合。

任选地，短连接子可在car的细胞外域、跨膜域和细胞内域中的任一者或一些之间形成键联。

在一个实施方案中，本发明的car中的跨膜域是cd8跨膜域。在一个实施方案中，cd8跨膜域包含seqidno:13的核酸序列的跨膜部分。在另一个实施方案中，cd8跨膜域包含编码seqidno:14内所含有的跨膜氨基酸序列的核酸序列。

在某些实施方案中，本发明的car中的跨膜域是cd28跨膜域。在一个实施方案中，cd28跨膜域包含seqidno:5的核酸序列。在一个实施方案中，cd28跨膜域包含编码seqidno:6的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，cd28跨膜域包含seqidno:6的氨基酸序列。

细胞内(细胞质)域。本发明的经工程改造的t细胞的细胞内(细胞质)域可提供免疫细胞的正常效应子功能的至少一者的活化。例如，t细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

应当理解，合适的细胞内分子包括(即，包含)但不限于cd28、cd28t、ox-40、4-1bb/cd137、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、可诱导型t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cdl-la/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd247、cd276(b7-h3)、light、(tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap-10、fcγ受体、mhc1类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、icam-1、b7-h3、cds、icam-1、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdlld、itgae、cd103、itgal、cdlla、lfa-1、itgam、cdllb、itgax、cdllc、itgbl、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、与cd83特异性结合的配体或其任何组合。

在优选实施方案中，car的细胞质域可设计成包含cd3ζ信号传送域本身或与在本发明的car的情形下可用的任何其他所要的细胞质域组合的cd3ζ信号传送域。例如，car的细胞质域可包含cd3ζ链部分及共刺激信号传送区。

本发明的car的细胞质信号传送部分内的细胞质信号传送序列可以随机或指定顺序彼此连接。

在一个优选实施方案中，细胞质域设计成包含cd3ζ的信号传送域及cd28的信号传送域。在另一个实施方案中，细胞质域设计成包含cd3ζ的信号传送域及4-1bb的信号传送域。在另一个实施方案中，本发明的car中的细胞质域设计成包含cd28及cd3ζ的一部分，其中细胞质cd28包含seqidno:7中所阐明的核酸序列及seqidno:8中所阐明的氨基酸序列。cd3ζ核酸序列阐明于seqidno:9中，且氨基酸序列阐明seqidno:8中。

应当理解，根据本发明的car的一个优选取向包含与共刺激域及活化域串联的抗原结合域(诸如scfv)。共刺激域可包含细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分中的一者或多者。应当进一步理解，可串联利用多个共刺激域。

在一些实施方案中，提供包含可操作地连接至编码抗原结合分子、至少一种共刺激分子和活化域的第一多核苷酸的启动子的核酸。

在一些实施方案中，核酸构建体容纳于病毒载体内。在一些实施方案中，病毒载体是选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、鼠白血病病毒载体、sfg载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体和牛痘病毒载体。在一些实施方案中，核酸容纳于质粒内。

本发明进一步涉及编码嵌合抗原受体的经分离的多核苷酸及包含所述多核苷酸的载体。所属领域中已知的任何载体可合适用于本发明。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体(诸如pmsvg1)、dna载体、鼠白血病病毒载体、sfg载体、质粒、rna载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、艾司坦巴尔(epsteinbarr)病毒载体、乳多泡病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(aav)、慢病毒载体(诸如pgar)或其任何组合。pgar载体图显示于图12中。pgar序列如下：

ctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactatagggcgacccggggatggcgcgccagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgctgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagccgccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgcgatcgcggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggttaggaacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtccttcgaagtagatctttgtcgatcctaccatccactcgacacacccgccagcggccgctgccaagcttccgagctctcgaattaattcacggtacccaccatggcctagggagactagtcgaatcgatatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtccttttcatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggttaattaaagtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcgaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcaggcatgccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttggcgcgccatcgtcgaggttccctttagtgagggttaattgcgagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac(seqidno:95)

合适的另外的示范性载体包括例如pbabe-puro、pbabe-neolargetcdna、pbabe-hygro-htert、pmko.1gfp、mscv-ires-gfp、pmscvpig(puroiresgfp空质粒)、pmscv-loxp-dsred-loxp-egfp-puro-wpre、mscvires荧光素酶、pmig、mdh1-pgk-gfp_2.0、ttrmpvir、pmscv-ires-mcherryfp、pretroxgfpt2acre、prxtn、plncexp和plxin-luc。

在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞是t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、nk细胞、tcr表达细胞、树突状细胞或nk-t细胞。在一些实施方案中，细胞是获自外周血或由其制备。在一些实施方案中，细胞是获自外周血单核细胞(pbmc)或由其制备。在一些实施方案中，细胞是获自骨髓或由其制备。在一些实施方案中，细胞是获自脐带血或由其制备。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是通过核酸载体使用选自由以下组成的组的方法来转染或转导：电穿孔、超声波穿孔(sonoporation)、生物弹击(biolistics)(例如，基因枪)、脂质转染、聚合物转染、纳米粒子或聚合体(polyplex)。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体在包含本申请的核酸的经工程改造的免疫细胞中表达。在一些实施方案中，本申请的所述嵌合抗原受体可包含(i)抗原结合分子(诸如scfv)、(ii)跨膜区和(iii)t细胞活化分子或区。

抗原结合分子

抗原结合分子在本发明范围内。

如本文所用的“抗原结合分子”意指结合指定靶抗原的任何蛋白质。在本申请中，指定靶抗原是flt3蛋白或其片段。抗原结合分子包括但不限于抗体及其结合部分，诸如免疫学功能片段。肽抗体(即，包含肽结合域的fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个实例。

在一些实施方案中，抗原结合分子结合至肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至涉及过度增生性疾病的细胞上的抗原或病毒或细菌抗原。在某些实施方案中，抗原结合分子结合至flt3。在进一步实施方案中，抗原结合分子是抗体或其片段，包括其互补决定区(cdr)中的一者或多者。在进一步实施方案中，抗原结合分子是单链可变片段(scfv)。

术语抗原结合分子的“免疫学功能片段”(或“片段”)是抗原结合分子的包含抗体的一部分(不管所述部分是如何获得或合成)的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。在一些实施方案中，片段是中和片段。在一些实施方案中，片段可阻断或降低flt3的活性。在一个方面中，此类片段将保留存在于全长轻链或重链中的至少一个cdr，且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。所述片段可通过重组dna技术产生，或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。

免疫学功能免疫球蛋白片段包括但不限于scfv片段、fab片段(fab'、f(ab')2和其类似者)、一个或多个cdr、双功能抗体(与轻链可变域相同的多肽上的重链可变域，所述重链可变域经由短肽连接子连接，所述短肽连接子过短以致无法允许相同链上的两个域之间的配对)、域抗体和单链抗体。所述片段可来源于任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科或兔。如所属领域技术人员将理解，抗原结合分子可包括非蛋白质组分。

抗原结合分子的变体也在本发明范围内，例如各自与本文所述的序列的氨基酸序列具有至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或高于99％同一性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，此类分子至少包括一个重链和一个轻链，而在其他情况下，变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链(或其子部分)。所属领域技术人员将能够使用熟知的技术确定如本文所阐明的抗原结合分子的合适变体。在某些实施方案中，所属领域技术人员可鉴别分子的可通过靶据信对于活性而言不重要的区来改变而不破坏活性的合适区域。

在某些实施方案中，抗原结合分子的多肽结构是基于抗体，分别包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体、合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(本文中有时称为“抗体缀合物”)和其片段。在一些实施方案中，抗原结合分子包含avimer或由其组成。

在一些实施方案中，flt3的抗原结合分子是单独施用。在其他实施方案中，flt3的抗原结合分子是作为car、tcr或其他免疫细胞的一部分施用。在此类免疫细胞中，flt3的抗原结合分子可在相同启动子区或分开的启动子的控制下。在某些实施方案中，编码蛋白质药剂和/或flt3的抗原结合分子的基因可在分开的载体中。

本发明进一步提供药物组合物，其包含flt3的抗原结合分子，连同药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在某些实施方案中，药物组合物将包括多于一种不同的flt3的抗原结合分子。在某些实施方案中，药物组合物将包括多于一种flt3的抗原结合分子，其中flt3的抗原结合分子结合多于一个表位。在一些实施方案中，各种抗原结合分子将不彼此竞争结合至flt3。

在其他实施方案中，药物组合物可经选择以供肠胃外递送、吸入或通过消化道递送，诸如经口递送。此类药学上可接受的组合物的制备是在所属领域技术人员的能力内。在某些实施方案中，缓冲剂用于将组合物维持在生理ph值或略微较低ph值下，通常在约5至约8的ph值范围内。在某些实施方案中，当考虑肠胃外施用时，治疗组合物可呈无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式，其包含在药学上可接受的媒介物中所要的flt3的抗原结合分子(其具有或不具有另外的治疗剂)。在某些实施方案中，用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，在所述无菌蒸馏水中将flt3的抗原结合分子(其具有或不具有至少一种另外的治疗剂)调配为适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施方案中，制备可涉及调配所要分子与可提供然后可经由储库注射递送的产品的控制或持续释放的聚合化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体。在某些实施方案中，可使用可植入药物递送装置来引入所要分子。

在一些实施方案中，抗原结合分子用作诊断或验证工具。抗原结合分子可用于分析样品和/或受试者中存在的flt3的量。在一些实施方案中，诊断性抗原结合分子不是中和的。在一些实施方案中，本文所公开的抗原结合分子用于或提供于用于检测哺乳动物组织或细胞中的flt3以筛检/诊断与flt3水平变化相关的疾病或病症的分析试剂盒和/或方法中。试剂盒可包含结合flt3的抗原结合分子，连同用于指示抗原结合分子与flt3的结合(若存在)及任选地flt3蛋白水平的构件。

将鉴于下文定义和描述进一步理解抗原结合分子。

“fc”区包含两个重链片段，其包含抗体的ch1及ch2域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键且通过ch3域的疏水性相互作用保持在一起。

“fab片段”包含一条轻链和一条重链的ch1与可变区。fab分子的重链不可与另一个重链分子形成二硫键。“fab'”片段”包含一条轻链以及一条重链的一部分，所述部分含有vh域及ch1域且也含有在ch1与ch2域之间的区，使得可在两个fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab')2分子。“f(ab')2片段”含有两条轻链及两条重链，所述两条重链含有在ch1与ch2域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，f(ab')2片段包含由两条重链之间的二硫键保持在一起的两个fab'片段。

“fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。

“单链可变片段”(“scfv”，也称为“单链抗体”)是指以下fv分子，在所述fv分子中重链可变区及轻链可变区已由柔性连接子连接以形成单个多肽链，所述单个多肽链形成抗原结合区。参见，pct申请wo88/01649及美国专利第4,946,778号及第5,260,203号，所述专利的公开内容以全文引用的方式并入。

“二价抗原结合分子”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合分子可以是双特异性的。“多特异性抗原结合分子”是靶向多于一种抗原或表位的分子。“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合分子是分别具有两个不同抗原结合位点的杂交抗原结合分子或抗体。双特异性抗原结合分子的两个结合位点将结合至可位于相同或不同蛋白质靶标上的两个不同的表位。

当解离常数(kd)是约1x10^-7m时，称抗原结合分子“特异性结合”其靶抗原。抗原结合分子在kd是1x10^-9m至5x10^-9m时，以“高亲和力”特异性结合抗原，且在kd是1x10^-10m至5x10^-10m时以“非常高的亲和力”结合。在一个实施方案中，抗原结合分子具有10^-9m的kd。在一个实施方案中，解离速率(off-rate)是<1x10^-5。在其他实施方案中，抗原结合分子将以约10^-7m与10^-13m之间的kd结合至人flt3，且在又一个实施方案中，抗原结合分子将以1.0x10^-10至5x10^-10的kd结合。

当抗原结合分子结合至一个靶标比结合至第二靶标更紧密时，称其是“选择性的”。

术语“抗体”是指具有任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合至靶抗原的片段，且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。“抗体”是如本文所定义的抗原结合分子的物种。完整抗体通常将至少包含两条全长重链及两条全长轻链，但在一些情况下可包括较少链，诸如天然存在于骆驼中的抗体，其仅可包含重链。抗体可仅仅来源于单个来源，或可以是嵌合的，即，抗体的不同部分可来源于如下文进一步所述的两种不同抗体。抗原结合分子、抗体或结合片段可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶裂解或化学裂解来在融合瘤中产生。除非另外指示，否则除了包含两条全长重链及两条全长轻链的抗体的外，术语“抗体”包括其衍生物、变体、片及突变蛋白(mutein)，其实例描述于下文。此外，除非明确排除，否则抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体、合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(本文中有时称为“抗体缀合物”)和其片段。

可变区通常展现3个高变区(即，“cdr”)所连接的相对保守的框架区(fr)的相同的一般结构。来自各对的两条链的cdr通常通过框架区比对，其可实现结合至特异性表位。从n端至c端，轻链可变区和重链可变区通常包含域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。按照惯例，重链中的cdr区通常称为hccdr1、cdr2和cdr3。轻链中的cdr区通常称为lccdr1、cdr2和cdr3。各域的氨基酸的指定通常根据kabat的定义(seqsofproteinsofimmunologicalinterest(nih,bethesda,md(1987及1991))或chothia(j.mol.biol.,196:901-917(1987)；chothia等人,nature,342:878-883(1989))。可采用各种分析方法来鉴别或估计cdr区，不仅包括kabat或chothia，还包括abm定义。

术语“轻链”包括全长轻链或其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包括可变区域vl及恒定区域cl。轻链的可变区域在多肽的氨基端处。轻链包括κ链及λ链。

术语“重链”包括全长重链或其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包括可变区域vh及三个恒定区域ch1、ch2和ch3。vh域在多肽的氨基端处，且ch域在羧基端处，而ch3最接近多肽的羧基端。重链可具有任何同种型，包括igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(包括iga1及iga2亚型)、igm和ige。

术语“可变区”或“可变域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常在重链中包括大约120至130个氨基端氨基酸且在轻链中包括约100至110个氨基端氨基酸。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。

变异性不是在抗体的整个可变域中均匀分布；其集中于重链可变区及轻链可变区的各者的子域中。所述子域称为“高变区”或“互补决定区”(cdr)。可变域的更保守(即，非高变的)部分称为“框架”区(frm或fr)，且为三维空间中的六个cdr提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的重链及轻链的可变域各自包含四个frm区域(fr1、fr2、fr3和fr4)，主要采用β片层构型，通过三个高变区连接，其形成环连接，且在一些情况下形成β片层结构的一部分。各链中的高变区通过frm紧密地保持在一起，且与来自另一条链的高变区一起促成形成抗原结合位点(参见，kabat等人，上文引用)。

术语“cdr”及其复数“cdr”是指互补决定区，所述互补决定区中的三个构成轻链可变区(cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)的结合特性，且三个构成重链可变区(cdrh1、cdr-h2和cdr-h3)的结合特性。cdr含有负责抗体与抗原的特异性相互作用的大多数残基，且因此促成抗体分子的功能活性：其是抗原特异性的主要决定子。

确切定义的cdr边界和长度受制于不同的分类及编号系统。因此，cdr可通过kabat、chothia、接触或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)来指代。尽管边界不同，但是所述系统中的各者在构成可变序列内的所谓“高变区”中具有一定程度的重叠。因此，根据所述系统的cdr定义的长度及边界区域相对于相邻框架区可能不同。参见，例如，kabat(基于交叉物种序列变异性的方法)、chothia(基于抗原-抗体复合体的结晶学研究的方法)和/或maccallum(kabat等人，上文引用；chothia等人,j.moi.biol,1987,196:901-917；和maccallum等人,j.moi.biol,1996,262:732)。用于特性化抗原结合位点的又另一个标准是oxfordmolecular的abm抗体建模软件所使用的abm定义。参见，例如，proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains.在antibodyengineeringlabmanual(编：duebel,s.及kontermann,r.,springer-verlag,heidelberg)中。在两个残基鉴别技术定义重叠的区而非相同区的情况下，其可经组合以定义杂合cdr。然而，根据所谓的kabat系统的编号是优选的。

通常，cdr形成可经分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指抗原结合(cdr)环所采用的主要链构象。根据比较性结构研究已发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的一组可用构象。各规范结构可由多肽骨架的扭转角特性化。因此，尽管环的大多数部分中的氨基酸序列变异性很高，但是抗体之间的对应环可具有非常类似的三维结构(chothia及lesk,j.moi.biol.,1987,196:901；chothia等人,nature,1989,342:877；martin及thornton,j.moi.biol,1996,263:800)。此外，在所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间有一定关系。特定规范类别的构象是由环的长度和存在于环内以及保守框架内(即，环的外部)的关键位置处的氨基酸残基确定。因此，特定规范类别的指定可基于这些关键氨基酸残基的存在来进行。

术语“规范结构”也可包括关于抗体的线性序列的考虑，例如，如kabat(kabat等人，上文引用)所编目。kabat编号方案(系统)是广泛采用的用于以一致方式对抗体可变域的氨基酸残基进行编号的标准，且是本发明中所应用的优选方案，也如本文别处所提及。另外的结构考虑也可用于确定抗体的规范结构。例如，未通过kabat编号完全反映出的那些差异可通过chothia等人的编号系统描述，且/或通过其他技术(例如，晶体学以及二维或三维计算建模)显示。因此，给定抗体序列可置于规范类别中，其尤其允许鉴别适当的底板(chassis)序列(例如，基于在文库中包括多种规范结构的期望)。kabat编号抗体氨基酸序列及结构考虑(如chothia等人(上文引用)以及其对于解释抗体结构的规范方面的启示所述)描述于文献中。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构及三维构型在所属领域中是众所周知的。对于抗体结构的综述，参见，antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,harlow等人编,1988。

轻链的cdr3及(特别是)重链的cdr3可在轻链可变区及重链可变区内的抗原结合中构成最重要的决定子。在一些抗体构建体中，重链cdr3似乎构成抗原与抗体之间的主要接触区域。单独改变cdr3的体外选择方案可用于改变抗体的结合性质或确定哪些残基有助于抗原的结合。因此，cdr3通常是抗体结合位点内分子多样性的最大来源。例如，h3可短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。

术语“中和”是指抗原结合分子、scfv或抗体分别结合至配体且防止或减小所述配体的生物效应。这可例如通过直接阻断配体上的结合位点或通过结合至配体且通过直接手段(诸如配体中的结构或能量改变)改变配体结合的能力来进行。在一些实施方案中，所述术语也可表示抗原结合分子防止其所结合的蛋白执行生物功能。

术语“靶标”或“抗原”是指能够由抗原结合分子结合的分子或分子的一部分。在某些实施方案中，靶标可具有一个或多个表位。

当在竞争相同表位的抗原结合分子的情形下使用时，术语“竞争”意指抗原结合分子之间如通过所测试的抗原结合分子(例如，抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如，减小)参考抗原结合分子特异性结合至抗原的分析所确定的竞争。许多类型的竞争性结合分析可用于确定一个抗原结合分子是否与另一个抗原结合分子竞争，例如：固相直接或间接放射免疫分析(ria)、固相直接或间接酶免疫分析(eia)、夹心竞争分析(stahli等人,1983,methodsinenzymology9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白eia(kirkland等人,1986,j.immunol.137:3614-3619)、固相直接标记分析、固相直接标记夹心分析(harlow及lane,1988,antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborpress)；使用1-125标记的固相直接标记ria(morel等人,1988,molec.immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白eia(cheung等人,1990,virology176:546-552)；和直接标记ria(moldenhauer等人,1990,scand.j.immunol.32:77-82)。术语“表位”包括能够由本发明的抗原结合分子诸如scfv、抗体或免疫细胞结合的任何决定子。表位是抗原的由靶向所述抗原的抗原结合分子所结合的区，且当抗原是蛋白质时，包括直接接触抗原结合分子的特异性氨基酸。

如本文所使用，术语“标记”或“经标记”是指例如通过并入经放射性标记的氨基酸或连接至可通过经标志的抗生物素蛋白检测的具有生物素部分的多肽(例如，含有可通过光学法或比色法检测的荧光标志物或酶活性的链霉抗生物素蛋白)来并入可检测标志物。在某些实施方案中，标记或标志物也可以是治疗性的。各种标记多肽及糖蛋白的方法是所属领域中已知的，且可供使用。

根据本发明，打开-关闭(on-off)或其他类型的控制开关技术可并入本文中。所述技术可采用对二聚化域和此类域二聚化的可选活化剂的使用。所述技术包括例如由wu等人,science2014350(6258)所述在某些细胞中利用fkbp/rapalog二聚化系统的技术，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。另外的二聚化技术描述于例如fegan等人chem.rev.2010,110,3315–3336以及美国专利第5,830,462号；第5,834,266号；第5,869,337号；和第6,165,787号中，所述文献的内容也以全文引用的方式并入本文中。另外的二聚化对可包括环孢菌素-a/亲环蛋白、受体、雌激素/雌激素受体(任选地使用他莫昔芬)、糖皮质素/糖皮质素受体、四环素/四环素受体、维生素d/维生素d受体。二聚化技术的进一步实例可见于例如wo2014/127261、wo2015/090229、us2014/0286987、us2015/0266973、us2016/0046700、美国专利第8,486,693号、us2014/0171649和us2012/0130076中，所述文献的内容进一步以全文引用的方式并入本文中。

治疗方法

使用过继性免疫疗法，天然t细胞可(i)从患者中移除；(ii)经遗传工程改造以表达结合至至少一种肿瘤抗原的嵌合抗原受体(car)；(iii)经离体扩增成更大的经工程改造的t细胞群体；且(iv)重新引入患者中。参见，例如，美国专利第7,741,465号及第6,319,494号、eshhar等人(cancerimmunol,同上)；krause等人(同上)；finney等人(同上)。在将经工程改造的t细胞重新引入至患者中后，其介导针对表达肿瘤抗原的细胞的免疫反应。参见，例如，krause等人,j.exp.med.,第188卷,第4期,1998(619–626)。此免疫反应包括t细胞分泌il-2及其他细胞因子、识别肿瘤抗原的t细胞的克隆扩增和t细胞介导的靶标阳性细胞的特异性杀伤。参见，hombach等人,journalofimmun.167:6123–6131(2001)。

在一些方面中，本发明因此包含一种用于治疗或预防患者的与非所要和/或升高的flt3水平相关的病状的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的至少一种本文所公开的经分离的抗原结合分子、car或tcr。

提供用于治疗疾病或病症(包括癌症)的方法。在一些实施方案中，本发明涉及在受试者中产生t细胞介导的免疫反应，其包含向受试者施用有效量的本申请的经工程改造的免疫细胞。在一些实施方案中，t细胞介导的免疫反应是针对一种或多种靶细胞。在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些方面中，本发明包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种本文所述的经分离的抗原结合分子。在一些方面中，本发明包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种免疫细胞，其中所述免疫细胞包含至少一种如本文所述的嵌合抗原受体、t细胞受体和/或经分离的抗原结合分子。

在一些方面中，本发明包含一种药物组合物，其包含至少一种如本文所述的抗原结合分子及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含另外的活性剂。

本发明的抗原结合分子、car、tcr、免疫细胞和类似者可用于治疗骨髓性疾病，所述骨髓疾病包括但不限于急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病(cml)、慢性粒单核细胞白血病(cmml)、幼年型粒单核细胞白血病、非典型慢性髓系白血病、急性早幼粒细胞白血病(apl)、急性单核细胞白血病、急性红白血病、急性巨核细胞白血病、骨髓增生异常综合征(mds)、骨髓增生性病症、髓系赘生物、髓系肉瘤)或其组合另外的疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、过敏、气喘、克罗恩氏病、ibd、ibs、纤维肌痛、肥大细胞增多症和乳糜泻。

应当理解，用于car⁺/car-t⁺/tcr⁺细胞的目标剂量的范围可为1x10⁶至2x10¹⁰个细胞/kg、优选为2x10⁶个细胞/kg、更优选。应当理解，高于及低于此范围的剂量可适合于某些受试者，且适当的剂量水平可由保健提供者根据需要来确定。另外，可根据本发明提供多个剂量的细胞。

也提供用于减小受试者的肿瘤大小的方法，其包括向受试者施用本发明的经工程改造的细胞，其中所述细胞包含嵌合抗原受体、t细胞受体或包含结合至肿瘤上的抗原的抗原结合分子的基于t细胞受体的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，受试者具有实体瘤或诸如淋巴瘤或白血病的血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，经工程改造的细胞经递送至肿瘤床。在一些实施方案中，癌症存在于受试者的骨髓中。

在一些实施方案中，经工程改造的细胞是自体t细胞。在一些实施方案中，经工程改造的细胞是同种异体t细胞。在一些实施方案中，经工程改造的细胞是异源t细胞。在一些实施方案中，本申请的经工程改造的细胞是体内转染或转导。在其他实施方案中，经工程改造的细胞是离体转染或转导。

所述方法可还包括施用一种或多种化学治疗剂。在某些实施方案中，化学治疗剂是淋巴细胞清除(预调节)化学治疗剂。有益的预调节治疗方案连同相关的有益的生物标志物描述于美国临时专利申请62/262,143及62/167,750中，所述专利特此以全文引用的方式并入本文中。所述专利描述例如用于调节需要t细胞疗法的患者的方法，其包括向患者施用指定有益剂量的环磷酰胺(介于200mg/m²/天与2000mg/m²/天之间)及指定剂量的氟达拉滨(介于20mg/m²/天与900mg/m²/天之间)。优选的剂量方案涉及治疗患者，其包括每日向患者施用约500mg/m²/天的环磷酰胺及约60mg/m²/天的氟达拉滨持续三天，之后向患者施用治疗有效量的经工程改造的t细胞。

在其他实施方案中，抗原结合分子、经转导的(或以其他方式经工程改造的)细胞(诸如car或tcr)和化学治疗剂各自以有效治疗受试者的疾病或病状的量施用。

在某些实施方案中，包含本文所公开的表达car的免疫效应细胞的组合物可结合任何数目的化学治疗剂施用。化学治疗剂的实例包括：烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺(cytoxan^tm)；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、麦曲多巴(meturedopa)和左多巴(uredopa)；乙烯亚胺类及甲基三聚氰胺类，包括六甲嘧胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamineresume)；氮芥类，诸如氮芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、环磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、氧化甲氮芥盐酸盐(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard))；亚硝基脲类(诸如亚硝基脲氮芥(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素c(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-fu；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺醣苷(aldophosphamideglycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地氟法胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；埃氟米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙基胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside，“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(taxol^tm,bristol-myerssquibb)及欧洲紫衫醇(doxetaxel)(rhone-poulencrorer)；氮芥苯丁酸；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂及卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；视黄酸衍生物，诸如targretin^tm(蓓萨罗丁)、panretin^tm、(阿利维a酸)；ontak^tm(地尼白介素)；卡培他滨；和以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中也包括用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、克昔芬、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。适当时，也施用化学治疗剂的组合，其包括但不限于chop，(即，环磷酰胺)、多柔比星(羟基多柔比星)、长春新碱和强的松。

在一些实施方案中，化学治疗剂是在施用经工程改造的细胞或核酸同时或之后一周内施用。在其他实施方案中，化学治疗剂是在施用经工程改造的细胞或核酸之后1至4周或1周至1个月、1周至2个月、1周至3个月、1周至6个月、1周至9个月或1周至12个月施用。在其他实施方案中，化学治疗剂是在施用细胞或核酸之前至少1个月施用。在一些实施方案中，所述方法还包含施用两种或更多种化学治疗剂。

多种另外的治疗剂可结合本文所述的组合物使用。例如，潜在有用的另外治疗剂包括pd-1抑制剂，诸如纳武单抗(nivolumab)派姆单抗(pembrolizumab)派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)。

合适用于与本发明组合使用的另外治疗剂包括但不限于依鲁替尼(ibrutinib)奥法木单抗(ofatumumab)利妥昔单抗(rituximab)贝伐单抗(bevacizumab)曲妥珠单抗(trastuzumab)贺癌宁(trastuzumabemtansine)伊马替尼西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)卡妥索单抗(catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本图希单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼、索拉非尼(sorafenib)、托西尼布(toceranib)、来他替尼、阿昔替尼、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼(tivozanib)、托西尼布、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、帕纳替尼(ponatinib)、拉多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、来他替尼、鲁索利替尼(ruxolitinib)、帕克替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、比美替尼(binimetinib)、艾乐替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克里唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿帝泼肽(adipotide)、地尼白介素(denileukindiftitox)、mtor抑制剂诸如依维莫司(everolimus)及西罗莫司(temsirolimus)、刺猬抑制剂(hedgehoginhibitor)诸如索尼德吉(sonidegib)及维莫德吉(vismodegib)、cdk抑制剂诸如cdk抑制剂(帕布昔利布(palbociclib))。

在另外的实施方案中，包含含有car免疫的组合物可与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物包括但不限于类固醇及糖皮质素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氢化可的松(hydrocortisoneacetate)、氢化可的松(hydrocortisone)、氢化可的松、甲基强的松龙(methylprednisolone)、强的松龙(prednisolone)、强的松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone))；非类固醇抗炎药(nsaids)，包括阿司匹林、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、抗tnf药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。示范性nsaid包括布洛芬、萘普生、萘普生钠、cox-2抑制剂和唾液酸酯(sialylate)。示范性止痛剂包括乙酰酚胺(acetaminophen)、羟考酮(oxycodone)、曲马多(tramadol)或盐酸普帕西芬(proporxyphenehydrochloride)。示范性糖皮质素包括可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、强的松龙或强的松。示范性生物反应修饰剂包括针对细胞表面标志物(例如，cd4、cd5等等)的分子、细胞因子抑制剂诸如tnf拮抗剂(例如，依那西普(etanercept)阿达木单抗及英夫利昔单抗趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应修饰剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示范性dmard包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹(hydroxychloroquine)、gold(口服(金诺芬(auranofin))及肌内)和米诺环素(minocycline)。

在某些实施方案中，本文所述的组合物是结合细胞因子施用。如本文所使用的“细胞因子”是指一个细胞群体所释放的作为细胞间介体作用于另一个细胞的蛋白质。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子中包括：生长激素，诸如人生长激素、n-甲硫胺酰人生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如滤泡刺激素(fsh)、甲状腺刺激素(tsh)和黄体成长激素(lh)；肝生长因子(hgf)；成纤维细胞生长因子(fgf)；催乳素；胎盘生乳素；缪勒氏抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合蛋白；血小板生成素(tpo)；神经生长因子(ngf)，诸如ngf-β；血小板生长因子；转化生长因子(tgf)，诸如tgf-α及tgf-β；胰岛素样生长因子-i及胰岛素样生长因子-ii；红细胞生成素(epo)；骨诱导因子(osteoinductivefactor)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(csf)，诸如巨噬细胞-csf(m-csf)；粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)；和粒细胞-csf(g-csf)；白介素(il)，诸如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-15；肿瘤坏死因子，诸如tnf-α或tnf-β；和其他多肽因子，包括lif及kit配体(kl)。如本文所使用，术语细胞因子包括来自天然来源或重组细胞培养物的蛋白质和生物活性当量的天然序列细胞因子。

在一些方面中，本发明包含以小于100pm的kd结合至flt3的抗原结合分子。在一些实施方案中，抗原结合分子以小于10pm的kd结合。在其他实施方案中，抗原结合分子以少于5pm的kd结合。

制备方法

多种已知技术可用于制备根据本发明的多核苷酸、多肽、载体、抗原结合分子、免疫细胞、组合物和类似者。

在本文所述的免疫细胞的体外操作或遗传修饰之前，可自受试者获得细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含t细胞。t细胞可获自许多来源，包括外周血单核细胞(pbmc)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜渗出液、脾组织和肿瘤。在某些实施方案中，t细胞可使用所属领域技术人员已知的许多技术(诸如ficoll^tm分离)获自从受试者收集的单位血液。细胞可优选通过单采血液成分术获自个体的循环血液。单采血液成分术产品通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在某些实施方案中，通过单采血液成分术所收集的细胞可经洗涤以移除血浆级分，且置于适当缓冲液或培养基中以进行后续加工。细胞可用pbs洗涤。如应当理解，可诸如通过使用半自动流过式离心机(semiautomatedflowthroughcentrifuge)(例如cobe^tm2991细胞处理机、baxtercytomate^tm或类似者)来使用洗涤步骤。洗涤后，细胞可重悬于多种生物相容性缓冲液或具有或不具有缓冲液的其他盐水溶液中。在某些实施方案中，可移除单采血液成分术样品的非所要组分。

在某些实施方案中，t细胞是通过溶解红细胞且清除单核细胞(例如经由percoll^tm梯度使用离心)来从pbmc中分离。可通过所属领域中已知的阳性或阴性选择技术进一步分离特异性t细胞亚群体，诸如cd28⁺、cd4⁺、cd8⁺、cd45ra⁺和cd45ro⁺t细胞。例如，通过阴性选择富集t细胞群体可用针对经阴性选择的细胞所特有的表面标志物的抗体的组合完成。用于本文的一种方法是经由阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于经阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物(cocktail)。例如，为了通过阴性选择富集cd4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包括cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。流式细胞术及细胞分选也可用于分离用于本发明中的所关注的细胞群体。

可直接使用pbmc以使用如本文所述的方法用免疫细胞(诸如car或tcr)进行遗传修饰。在某些实施方案中，在分离pbmc之后，可进一步分离t淋巴细胞，且在遗传修饰和/或扩增之前或之后，细胞毒性t淋巴细胞及辅助t淋巴细胞均可经分选成初始t细胞、记忆t细胞和效应t细胞亚群体。

在一些实施方案中，cd8⁺细胞通过鉴别细胞表面抗原来进一步分选成初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞，所述细胞表面抗原与所述类型的cd8⁺细胞中的各者相关。在一些实施方案中，中央记忆t细胞的表型标志物的表达包括cd45ro、cd62l、ccr7、cd28、cd3和cd127，且对粒酶b是阴性的。在一些实施方案中，中央记忆t细胞是cd45ro⁺、cd62l⁺、cd8⁺t细胞。在一些实施方案中，效应t细胞对cd62l、ccr7、cd28和cd127是阴性的，且对粒酶b及穿孔蛋白是阳性的。在某些实施方案中，cd4⁺t细胞进一步分选成亚群体。例如，cd4⁺t辅助细胞可通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群体来分选成初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞。

免疫细胞(诸如t细胞)可在分离后使用已知方法来遗传修饰，或免疫细胞可在遗传修饰之前体外活化且扩增(或在祖细胞的情况下经分化)。在另一个实施方案中，免疫细胞(诸如t细胞)用本文所述的嵌合抗原受体来遗传修饰(例如，用包含编码car的一种或多种核苷酸序列的病毒载体转导)，然后体外活化且/或扩增。用于活化及扩增t细胞的方法是所属领域中已知的，且描述于例如在美国专利第6,905,874号；美国专利第6,867,041号；美国专利第6,797,514号；和pctwo2012/079000中，所述专利的内容特此以全文引用的方式并入。通常，此类方法包括在具有适当细胞因子(诸如il-2)的培养基中将pbmc或经分离的t细胞与通常连接至珠粒或其他表面的刺激药剂及共刺激药剂(诸如抗cd3及抗cd28抗体)接触。连接至相同珠粒的抗cd3及抗cd28抗体用作“替代”抗原呈递细胞(apc)。一个实例是系统，即针对人t细胞的生理活化的cd3/cd28活化剂/刺激剂系统。

在其他实施方案中，t细胞可经活化且经刺激以使用诸如以下中所述的方法的方法与饲养细胞及适当抗体与细胞因子一起增殖：美国专利第6,040,177号；美国专利第5,827,642号；和wo2012129514，所述专利的内容特此以全文引用的方式并入。

用于制备本发明的构建体及经工程改造的免疫细胞的某些方法描述于pct申请pct/us15/14520中，所述申请的内容特此以全文引用的方式并入。制备构建体及细胞的另外方法可见于美国临时专利申请第62/244036号中，所述申请的内容特此以全文引用的方式并入。

应当理解，pbmc可进一步包括其他细胞毒性淋巴细胞，诸如nk细胞或nkt细胞。携带如本文所公开的嵌合受体的编码序列的表达载体可引入至人供体t细胞、nk细胞或nkt细胞的群体中。携带表达载体的经成功转导的t细胞可使用流式细胞术分选，以分离cd3阳性t细胞，然后除使用抗cd3抗体及il-2或如本文别处所述的所属领域中已知的其他方法进行细胞活化的外，经进一步增殖以增加所述car表达t细胞的数目。标准程序用于冷冻保存表达car的t细胞以供储存和/或制备以用于人受试者。在一个实施方案中，t细胞的体外转导、培养和/或扩增在不存在非人动物衍生的产物(诸如胎牛血清(fetalcalfserum及fetalbovineserum))的情况下执行。

为了克隆多核苷酸，可将载体引入至宿主细胞(经分离的宿主细胞)中，以允许载体本身的复制，从而扩增其中所含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可含有序列组分，其通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和可选择标志物。这些元件可由所属领域中的普通技术人员适当时选择。例如，复制起点可经选择以促进载体在宿主细胞中的自主复制。

在某些实施方案中，本公开提供含有本文所提供的载体的经分离的宿主细胞。含有载体的宿主细胞可用于载体中所含的多核苷酸的表达或克隆。合适的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞，诸如哺乳动物细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(例如，大肠杆菌)；肠杆菌属；伊文氏杆菌属；克留氏菌属；变形杆菌属；沙氏杆菌属(例如，鼠伤寒沙氏杆菌)；沙雷氏菌属(例如，粘质沙雷氏菌)；和志贺杆菌属；以及芽孢杆菌属(诸如，枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌)、假单胞菌属(诸如绿脓杆菌)和链霉菌属。

载体可使用所属领域中已知的任何合适方法引入至宿主细胞，所述方法包括但不限于deae-葡聚糖介导的递送、磷酸钙沉淀法、阳离子脂质介导的递送、脂质体介导的转染、电穿孔、微粒轰击(microprojectilebombardment)、受体介导的基因递送、由聚赖氨酸、组蛋白、壳聚糖和肽介导的递送。用于转染及转化用于表达所关注的载体的细胞的标准方法是所属领域中众所周知的。在进一步实施方案中，不同表达载体的混合物可用于遗传修饰免疫效应细胞的供体群体，其中各载体编码如本文所公开的不同car。所得经转导的免疫效应细胞形成经工程改造的细胞的混合群体，其中经工程改造的细胞群体表达多于一种不同的car。

在一个实施方案中，本发明提供一种储存表达靶向flt3蛋白的car或tcr的经遗传工程改造的细胞的方法。此涉及冷冻保存免疫细胞，使得细胞在解冻时保持活力。一部分表达car的免疫细胞的可通过所属领域中已知的方法冷冻保存，以为将来治疗患有恶性肿瘤的患者提供此类细胞的永久来源。当需要时，冷冻保存的经转化的免疫细胞可经解冻、生长和扩增以获得更多此类细胞。

如本文所使用，“冷冻保存”是指通过冷却至零下温度(诸如(通常)77开尔文或-196℃(液氮的沸点))来保存细胞。冷冻保护剂常常在零下温度下使用，以防止所保存的细胞由于在低温下冷冻或温至室温而损坏。冷冻保存剂及最佳冷却速率可防止细胞损伤。可根据本发明使用的冷冻保护剂包括但不限于：二甲亚砜(dmso)(lovelock&bishop,nature(1959)；183:1394-1395；ashwood-smith,nature(1961)；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(rinfret,ann.n.y.acad.sci.(1960)；85:576)和聚乙二醇(sloviter&ravdin,nature(1962)；196:48)。优选的冷却速率为1℃至3℃/分钟。

术语“实质上纯的”用于指示给定组分以高水平存在。组分合意地是存在于组合物中的主要组分。优选的是，其存在的水平多于30％、多于50％、多于75％、多于90％或甚至多于95％，所述水平是在相对于所考虑的总组合物的干重/干重基础上确定。在非常高的水平下(例如，在多于90％、多于95％或多于99％的水平下)，所述组分可视为“纯形式”。本发明的生物活性物质(包括多肽、核酸分子、抗原结合分子、部分)可以实质上不含所述物质可以其他方式缔合的一种或多种污染物的形式提供。当组合物实质上不含给定污染物时，所述污染物将在低水平下(例如，在上文阐述的干重/干重基础上，在小于10％、小于5％或小于1％的水平下)。

在一些实施方案中，细胞通过以下来调配：首先从细胞培养基收获细胞，然后洗涤并将细胞以治疗有效量浓缩于合适于施用的介质及容器系统(“药学上可接受的”载体)中。合适的输注介质可以是任何等渗介质调配物，通常是生理盐水、normosol^tmr(abbott)或plasma-lyte^tma(baxter)，但也可利用5％右旋糖水溶液或林格氏乳酸盐。输注介质可补充有人血清白蛋白。

组合物中细胞的所要治疗量通常为至少2个细胞(例如，至少1个cd8⁺中央记忆t细胞及至少1个cd4⁺辅助t细胞亚组)或更通常为大于10²个细胞，且多达10⁶、多达且包括10⁸或10⁹个细胞，且可为多于10¹⁰个细胞。细胞的数目将取决于组合物所意欲的所要用途和其中包括的细胞类型。所要细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，且通常大于10⁷个细胞/ml，通常是10⁸个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可分配成多次输注，其累积等于或超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。在本发明的一些方面中，特别是因为所有输注细胞将复位向至特定靶抗原(flt3)，所以可施用较低数目的细胞，其范围为10⁶/千克(10⁶至10¹¹个/患者)。car治疗可以所述范围内的剂量施用多次。细胞可以是自体的、同种异体的或对经受疗法的患者异源的。

本发明的car表达细胞群体可单独施用或作为与稀释剂和/或其他组分(诸如il-2或其他细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物施用。本发明的药物组合物可包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的car或tcr表达细胞群体(诸如t细胞)。此类组合物可包含：缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水和类似者；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选调配用于静脉内施用。

药物组合物(溶液、悬浮液或类似者)可包括以下的一者或多者：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发油诸如可用作溶剂或悬浮介质的合成的单甘油酯或双甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整渗性的药剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。

应当理解，通过用自杀基因转导免疫细胞(含有一种或多种car或tcr)可使不利事件最小化。也可期望将可诱导型“打开”或“加速”开关并入至免疫细胞中。合适的技术包括在用本发明的car构建体转导细胞之前、之后或同时使用可诱导型半胱天冬酶-9(caspase-9)(美国申请2011/0286980)或胸苷激酶。用于引入自杀基因和/或“打开”开关的另外方法包括talens、锌指、rnai、sirna、shrna、反义技术和所属领域中已知的其他技术。

应当理解，本文中的描述仅是示范性及解释性的，且不限制所主张的本发明。在本申请中，除非另外明确说明，否则使用单数包括复数。

本文所使用的章节标题仅出于组织目的且不应解释为限制所描述的目标物。本申请中引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文)特此明确地出于任何目的以全文引用的方式并入。如根据本公开所用，除非另外指示，否则以下术语应理解成具有以下含义：

在本申请中，除非另外说明，否则使用“或”是指“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其他形式(诸如“包括(includes)”及“包括(included)”)不具有限制性。同样，除非另外明确说明，否则诸如“元件”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的元件及组分与包含多于一个次单元的元件及组分两者。

术语“flt3活性”包括flt3的任何生物效应。在某些实施方案中，flt3活性包括flt3与受质或受体相互作用或结合至受质或受体的能力。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”包括单链及双链核苷酸聚合物。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸类型的经修饰形式。所述修饰包括：碱基修饰(诸如，溴尿苷及肌苷衍生物)；核糖修饰，诸如2',3'-二脱氧核糖；和核苷酸间键联修饰，诸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯(phosphoro-anilothioate)、苯氨基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。

术语“寡核苷酸”是指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如，以用于构建突变基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测分析的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如pcr引子、克隆引子或杂交探针。

术语“控制序列”是指可影响所连接的编码序列的表达及加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可取决于宿主生物体。在特定实施方案中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可包括启动子(其包含转录因子的一个或复数个识别位点)、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可包括前导序列(信号肽)和/或融合搭配物序列。

如本文所使用，“可操作地连接”意指所述术语所应用的组分是以允许其在合适条件下实现其固有功能的关系。

术语“载体”意指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。术语“表达载体”或“表达构建体”是指以下载体，所述载体合适于宿主细胞的转化且含有指导和/或控制(结合宿主细胞)可操作地连接至所述载体的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列。表达构建体可包括但不限于影响或控制转录、翻译且(若内含子存在)影响可操作地连接至内含子的编码区的rna剪接的序列。

术语“宿主细胞”是指已经或能够用核酸序列转化从而表达所关注的基因的细胞。术语包括亲本细胞的后代，无论所述后代在形态上或在遗传构成上是否与原始亲本细胞相同，只要感兴趣的基因存在即可。

术语“转化”是指细胞遗传特性的变化，且当细胞已经修饰以含有新的dna或rna时，细胞已经转化。例如，当细胞通过经由转染、转导或其他技术引入新的遗传物质来从其天然状态进行遗传修饰时，细胞是经转化。在转染或转导后，转化dna可通过物理整合至细胞的染色体中来与细胞的dna重组，或可在未复制的情况下作为附加型元件瞬时地维持，或可作为质粒独立地复制。当转化dna随着细胞的分裂复制时，细胞被视为已“稳定转化”。

术语“转染”是指由外来或外源dna由细胞吸收。许多转染技术在所属领域中众所周知，且在本文中公开。参见，例如，graham等人,1973,virology52:456；sambrook等人,2001,molecularcloning:alaboratorymanual,同上；davis等人,1986,basicmethodsinmolecularbiology,elsevier；chu等人,1981,gene13:197。

术语“转导”是指外来dna经由病毒载体引入至细胞中的过程。参见，jones等人,(1998).genetics:principlesandanalysis.boston:jones&bartlettpubl。

术语“多肽”或“蛋白质”是指具有蛋白质的氨基酸序列的巨分子，其包括天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代。术语“多肽”及“蛋白质”具体涵盖flt3抗原结合分子、抗体或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白相比具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白相比，此类片段也可含有经修饰的氨基酸。有用的多肽片段包括抗原结合分子的免疫学功能片段。有用的片段包括但不限于一个或多个cdr区、重链和/或轻链的可变域、抗体链的其他部分的一部分和类似者。

术语“经分离”意指(i)不含至少一些通常一起可见的其他蛋白质；(ii)基本上不含来自相同来源(例如来自相同物种)的其他蛋白质；(iii)与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或在自然界中与的缔合的其他材料分离；(iv)与在自然界中未与的缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(v)在自然界中不存在。

多肽(例如，抗原结合分子或抗体)的“变体”包含以下氨基酸序列，在所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基相对于另一个多肽序列插入、缺失和/或取代至所述氨基酸序列中。变体包括融合蛋白。

术语“同一性”是指两种或更多种多肽分子或两种或更多种核酸分子的序列之间的关系，如通过比对及比较所述序列所确定。“同一性百分比”意指经比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同的残基的百分比，且是基于所比较的最小分子的大小计算。对于所述计算，比对的缺口(若存在)优选通过特定数学模型或计算器程序(即，“算法”)来寻址。

为了计算同一性百分比，所比较的序列通常是以得到序列之间最大匹配的方式比对。可用于确定同一性百分比的计算器程序的一个实例是gcg程序包，其包括gap(devereux等人,1984,nucl.acidres.12:387；geneticscomputergroup,universityofwisconsin,madison,wis.)。计算器算法gap用于比对欲确定序列同一性百分比的两种多肽或多核苷酸。所述序列经比对以用于其各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，如通过算法所确定)。在某些实施方案中，算法也使用标准比较矩阵(参见，针对pam250比较矩阵，dayhoff等人,1978,atlasofproteinsequenceandstructure5:345-352；针对blosum62比较矩阵，henikoff等人,1992,proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:10915-10919)。

如本文所使用，二十种常规(例如，天然存在的)氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见，immunology-asynthesis(第2版,golub及gren,编,sinauerassoc.,sunderland,mass.(1991))，所述文献出于任何目的以引用的方式并入本文中。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，d-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-氨基酸、α-二取代氨基酸、n-烷基氨基酸、乳酸及、其他非常规氨基酸也可为本发明的多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-n,n,n-三甲基赖氨酸、e-n-乙酰赖氨酸、o-磷酸丝氨酸、n-乙酰丝氨酸、n-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-n-甲基精氨酸、以及其他类似氨基酸及亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所使用的多肽符号中，根据标准使用及惯例，左手方向是氨基端方向，且右手方向是羧基端方向。

保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成来并入。所述氨基酸包括拟肽物及其他逆转或反向形式的氨基酸部分。天然存在的残基可基于共同的侧链性质分为以下类别：

a)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

b)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；

c)酸性：asp、glu；

d)碱性：his、lys、arg；

e)影响链取向的残基：gly、pro；和

f)芳族：trp、tyr、phe。

例如，非保守取代可涉及将所述类别中一者的成员交换为来自另一类别的成员。此类经取代的残基可例如引入至与非人抗体同源的人抗体区或分子的非同源区中。

根据某些实施方案，在对抗原结合分子、经工程改造的t细胞的共刺激或活化域进行改变时，可考虑氨基酸的疏水指数(hydropathicindex)。已基于各氨基酸的疏水性及电荷特性来指定所述氨基酸的疏水指数。其为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷酰氨酸(-3.5)；天冬氨酸酯(-3.5)；天冬酰氨酸(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。参见，kyte等人,j.mol.biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可由具有相似疏水指数或分数的其他氨基酸取代，且仍保留类似的生物活性。在所属领域中也应理解，特别是当由此产生的生物功能蛋白质或肽意欲用于免疫学实施方案中时，如在当前情况下，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。示范性氨基酸取代阐明于表2中。

表2

术语“衍生物”是指除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代以外也包括化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包含共价修饰，其包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施方案中，经化学修饰的抗原结合分子可比未经化学修饰的抗原结合分子具有更长的循环半衰期。在一些实施方案中，衍生的抗原结合分子经共价修饰以包括一种或多种水溶性聚合物连接，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。

肽类似物通常在制药工业中用作非肽药物，其具有与模板肽的性质类似的性质。所述类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“拟肽物”。fauchere,j.,adv.drugres.,15:29(1986)；veber及freidinger,tins,第392页(1985)；和evans等人,j.med.chem.,30:1229(1987)，所述文献出于任何目的以引用的方式并入本文中。

术语“治疗有效量”是指经确定在哺乳动物中产生治疗反应的flt3抗原结合分子的量。此类治疗有效量易于由所属领域中的普通技术人员确定。

术语“患者”及“受试者”可互换使用，且包括人及非人动物受试者、以及具有经正式诊断的病症的受试者、不具有经正式识别的病症的受试者、接受医疗照顾的受试者、处于发展病症的风险中的受试者等等。

术语“治疗(treat)”及“治疗(treatment)”包括减少受试者将发展病症的风险或其他风险因素的治疗性治疗、预防性治疗和应用。治疗不需要完全治愈病症，且涵盖减少症状或潜在风险因素的实施方案。术语“预防”不需要100％消除事件的可能性。相反，其表示事件发生的可能性在所述化合物或方法的存在下降低。

标准技术可用于重组dna、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如，电穿孔、脂转染)。可根据制造商说明书或如所属领域中通常所达成或如本文所述来执行酶促反应及纯化技术。前述技术及程序可通常根据在所属领域中众所周知及如本说明书整篇引用及论述的各种一般性及更具体参考文献中所述的习用方法来执行。参见，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989))，所述文献出于任何目的以引用的方式并入本文中。

以下序列将进一步例证本发明。

cd28tdna细胞外、跨膜、细胞内

cttgataatgaaaagtc

aaacggaacaatcattcacgtgaagggcaagcacctctgtccgtcacccttgttccctggtccatccaagccattctgggtgttggtcgtagtgggtggagtcctcgcttgttactctctgctcgtcaccgtggcttttataatcttctgggttagatccaaaagaagccgcctgctccatagcgattacatgaatatgactccacgccgccctggccccacaaggaaacactaccagccttacgcaccacctagagatttcgctgcctatcggagc(seqidno:1)

cd28taa细胞外、跨膜、细胞内：

ldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seqidno:2)

cd28tdna-细胞外

cttgataatgaaaagtcaaacggaacaatcattcacgtgaagggcaagcacctctgtccgtcacccttgttccctggtccatccaagcca(seqidno:3)

cd28taa-细胞外

ldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp(seqidno:4)

cd28dna跨膜域

ttctgggtgttggtcgtagtgggtggagtcctcgcttgttactctctgctcgtcaccgtggcttttataatcttctgggtt(seqidno:5)

cd28aa跨膜域：

fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seqidno:6)

cd28dna细胞内域：

agatccaaaagaagccgcctgctccatagcgattacatgaatatgactccacgccgccctggccccacaaggaaacactaccagccttacgcaccacctagagatttcgctgcctatcggagc(seqidno:7)

cd28aa细胞内域

rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seqidno:8)

cd3ζdna

agggtgaagttttccagatctgcagatgcaccagcgtatcagcagggccagaaccaactgtataacgagctcaacctgggacgcagggaagagtatgacgttttggacaagcgcagaggacgggaccctgagatgggtggcaaaccaagacgaaaaaacccccaggagggtctctataatgagctgcagaaggataagatggctgaagcctattctgaaataggcatgaaaggagagcggagaaggggaaaagggcacgacggtttgtaccagggactcagcactgctacgaaggatacttatgacgctctccacatgcaagccctgccacctagg(seqidno:9)

cd3ζaa

rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:10)

cd28dna

attgaggtgatgtatccaccgccttacctggataacgaaaagagtaacggtaccatcattcacgtgaaaggtaaacacctgtgtccttctcccctcttccccgggccatcaaagccc(seqidno:11)

cd28aa

ievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp(seqidno:12)

cd8dna细胞外及跨膜域

gctgcagcattgagcaactcaataatgtattttagtcactttgtaccagtgttcttgccggctaagcctactaccacacccgctccacggccacctaccccagctcctaccatcgcttcacagcctctgtccctgcgcccagaggcttgccgaccggccgcagggggcgctgttcataccagaggactggatttcgcctgcgatatctatatctgggcacccctggccggaacctgcggcgtactcctgctgtccctggtcatcacgctctattgtaatcacaggaac(seqidno:13)

cd8aa细胞外及跨膜域

aaalsnsimyfshfvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrn(seqidno:14)

克隆10e3hcdna

caggtcaccttgaaggagtctggtcctgtgctggtgaaacccacagagaccctcacgctgacctgcaccgtctctgggttctcactcatcaatgctagaatgggtgtgagctggatccgtcagcccccagggaaggccctggagtggcttgcacacattttttcgaatgccgaaaaatcgtacaggacatctctgaagagcaggctcaccatctccaaggacacctccaaaagccaggtggtccttaccatgaccaacatggaccctgtggacacagccacatattactgtgcacggataccaggctacggtggtaacggggactaccactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca(seqidno:15)

克隆10e3hcaa–cdr加底线

qvtlkesgpvlvkptetltltctvsgfslinarmgvswirqppgkalewlahifsnaeksyrtslksrltiskdtsksqvvltmtnmdpvdtatyycaripgyggngdyhyygmdvwgqgttvtvss(seqidno:16)

克隆10e3hcaacdr1：narmgvs(seqidno:17)

克隆10e3hcaacdr2：hifsnaeksyrtslks(seqidno:18)

克隆10e3hcaacdr3：ipgyggngdyhyygmdv(seqidno:19)

克隆10e3lcdna

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctctaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagcgcctgatctatgcttcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacagcataataatttcccgtggacgttcggtcagggaacgaaggtggaaatcaaacga(seqidno:20)

克隆10e3lcaa(cdr加底线)

diqmtqspsslsaslgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapkrliyasstlqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyclqhnnfpwtfgqgtkveikr(seqidno:21)

克隆10e3lccdr1aa：rasqgirndlg(seqidno:22)

克隆10e3lccdr2aa：asstlqs(seqidno:23)

克隆10e3lccdr3aa：lqhnnfpwt(seqidno:24)

克隆2e7hcdna

caggtcaccttgaaggagtctggtcctgtgctggtgaaacccacagagaccctcacgctgacctgcaccgtctctgggttctcactcaggaatgctagaatgggtgtaagctggatccgtcagcctcccgggaaggccctggagtggcttgcacacattttttcgaatgacgaaaaaacctacagcacatctctgaagagcaggctcaccatctccagggacacctccaaaggccaggtggtccttaccatgaccaagatggaccctgtggacacagccacatattactgtgcacggataccctactatggttcggggagtcataactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca(seqidno:25)

克隆2e7hcaa(cdr加底线)

qvtlkesgpvlvkptetltltctvsgfslrnarmgvswirqppgkalewlahifsndektystslksrltisrdtskgqvvltmtkmdpvdtatyycaripyygsgshnygmdvwgqgttvtvss(seqidno:26)

克隆2e7hcaacdr1：narmgvs(seqidno:17)

克隆2e7hcaacdr2：hifsndektystslks(seqidno:26)

克隆2e7hcaacdr3：ipyygsgshnygmdv(seqidno:27)

克隆2e7lcdna

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcaggacattagaaatgatttcggctggtatcaacagaaaccagggaaagcccctcagcgcctgctctatgctgcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacagtataatacttacccgtggacgttcggtcagggaacgaaggtggaaatcaaacga(seqidno:28)

克隆2e7lcaa(cdr加底线)

diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdirndfgwyqqkpgkapqrllyaastlqsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyclqyntypwtfgqgtkveikr(seqidno:29)

克隆2e7lcaacdr1：rasqdirndfg(seqidno:30)

克隆2e7lcaacdr2：aastlqs(seqidno:31)

克隆2e7lhcaacdr3：lqyntypwt(seqidno:32)

克隆8b5hcdna

cagatacaactggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgtagcgtctggattcaccttcaagaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatttggtatgatggaagtaatgaatactatggagaccccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaactccaagaacatgttgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgatgacacggctgtgtattactgtgcgaggtcgggaatagcagtggctggggcctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca(seqidno:33)

克隆8b5hcaa(cdr加底线)

qiqlvesgggvvqpgrslrlscvasgftfknygmhwvrqapgkglewvaviwydgsneyygdpvkgrftisrdnsknmlylqmnslraddtavyycarsgiavagafdywgqgtlvtvss(seqidno:34)

克隆8b5hcaacdr1：nygmh(seqidno:34)

克隆8b5hcaacdr2：viwydgsneyygdpvkg(seqidno:35)

克隆8b5hcaacdr3：sgiavagafdy(seqidno:36)

克隆8b5lcdna

gaaattgtgttgacgcagtctccagacaccctgtctttgtctccaggggaaaaagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagcttcttggcctggtaccagcagaaacctggacaggctcccagtctcctcatctatgttgcatccagaagggccgctggcatccctgacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttggaatgttttactgtcaacactatggtaggacaccattcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaacga(seqidno:37)

克隆8b5lcaa(cdr加底线)

eivltqspdtlslspgekatlscrasqsvsssflawyqqkpgqapslliyvasrraagipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfgmfycqhygrtpftfgpgtkvdikr(seqidno:41)

克隆8b5lcaacdr1：rasqsvsssfla(seqidno:38)

克隆8b5lcaacdr2：vasrraa(seqidno:39)

克隆8b5lcaacdr3：qhygrtpft(seqidno:40)

克隆4e9hcdna

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccggctactatatacactgggtgcgacaggcccctgaacaagggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatggccagggacacgtccatcagcacagtttacatggacctgagcaggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaatacgcggtggtaactcggtctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca(seqidno:41)

克隆4e9hcaa(cdr加底线)

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyyihwvrqapeqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmardtsistvymdlsrlrsddtavyycarirggnsvfdywgqgtlvtvss(seqidno:42)

克隆4e9hcaacdr1：gyyih(seqidno:43)

克隆4e9hcaacdr2：winpnsggtnyaqkfqg(seqidno:44)

克隆4e9hcaacdr3：irggnsvfdy(seqidno:45)

克隆4e9lcdna

gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccacccagagtattttatacacctccaacaataagaacttcttagcttggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaaactgctcatttcctgggcatctatccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcgctctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacaatattttagtactatgttcagttttggccaggggaccaagctggagatcaaacga(seqidno:46)

克隆4e9lcaa(cdr加底线)

divmtqspdslavslgeratinckstqsilytsnnknflawyqqkpgqppklliswasiresgvpdrfsgsgsgtdfaltisslqaedvavyycqqyfstmfsfgqgtkleikr(seqidno:47)

克隆4e9lcaacdr1：kstqsilytsnnknfla(seqidno:48)

克隆4e9lcaacdr2：wasires(seqidno:49)

克隆4e9lcaacdr3：qqyfstmfs(seqidno:50)

克隆11f11hcdna

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagtagtggtgcatactactggacttggatccgccagcacccagggaagggcctggagtggattgggtacatccattacagtgggagcacctactccaacccgtccctcaagagtcgaattaccatatcgttagacacgtctaagaaccagttctccctgaagctgaactctgtgactgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagacaagaggactacggtggtttgtttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtttcctca(seqidno:51)

克隆11f11hcaa(cdr加底线)

qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsissgayywtwirqhpgkglewigyihysgstysnpslksritisldtsknqfslklnsvtaadtavyycarqedygglfdywgqgtlvtvss(seqidno:52)

克隆11f11hcaacdr1：sgayywt(seqidno:53)

克隆11f1hcaacdr2：yihysgstysnpslks(seqidno:54)

克隆11f1hcaacdr3：qedygglfdy(seqidno:55)

克隆11f11lcdna

gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagaatcaccctctcctgcagggccagtcagagtgttaccaccgacttagcctggtaccagcagatgcctggacaggctccccggctcctcatctatgatgcttccaccagggccactggtttcccagccagattcagtggcagtgggtctgggacagacttcacgctcaccatcagcagcctgcaggctgaagattttgcagtttattactgtcaacattataaaacctggcctctcactttcggcggagggactaaggtggagatcaaacga(seqidno:56)

克隆11f11lcaa(cdr加底线)

eivmtqspatlsvspgeritlscrasqsvttdlawyqqmpgqaprlliydastratgfparfsgsgsgtdftltisslqaedfavyycqhyktwpltfgggtkveikr(seqidno:57)

克隆11f11lcaacdr1：rasqsvttdla(seqidno:58)

克隆11f1lcaacdr2：dastrat(seqidno:59)

克隆11f1lcaacdr3：qhyktwplt(seqidno:60)

构建体10e3cd28dna(信号序列为粗体)

构建体10e3cd28aa(信号序列为粗体；cdr加底线)

构建体10e3cd28tdna(信号序列为粗体)

构建体10e3cd28taa(信号序列为粗体；cdr加底线)

构建体10e3cd8dna(信号序列为粗体)

构建体10e3cd8aa(信号序列为粗体；cdr加底线)

构建体8b5cd28dna(信号序列为粗体)

构建体8b5cd28aa(信号序列为粗体)

构建体8b5cd28tdna(信号序列为粗体)

构建体8b5cd28taa(信号序列为粗体)

构建体8b5cd8dna(信号序列为粗体)

构建体8b5cd8aa(信号序列为粗体)

构建体4e9cd28dna(信号序列为粗体)

构建体4e9cd28aa(信号序列为粗体)

构建体4e9cd28tdna(信号序列为粗体)

构建体4e9cd28taa(信号序列为粗体)

构建体4e9cd8dna(信号序列为粗体)

构建体4e9cd8aa(信号序列为粗体)

构建体11f11cd28dna(信号序列为粗体)

构建体11f11cd28aa(信号序列为粗体)

构建体11f11_cd28t_dna(信号序列为粗体)

构建体11f11cd28taa(信号序列为粗体)

构建体11f11cd8dna(信号序列为粗体)

构建体11f11cd8aa(信号序列为粗体)

人flt3nm_004119aa

mpalardggqlpllvvfsamifgtitnqdlpvikcvlinhknndssvgksssypmvsespedlgcalrpqssgtvyeaaavevdvsasitlqvlvdapgnisclwvfkhsslncqphfdlqnrgvvsmvilkmtetqageyllfiqseatnytilftvsirntllytlrrpyfrkmenqdalvcisesvpepivewvlcdsqgesckeespavvkkeekvlhelfgtdirccarnelgrectrlftidlnqtpqttlpqlflkvgeplwirckavhvnhgfgltwelenkaleegnyfemstystnrtmirilfafvssvarndtgyytcssskhpsqsalvtivekgfinatnssedyeidqyeefcfsvrfkaypqirctwtfsrksfpceqkgldngysiskfcnhkhqpgeyifhaenddaqftkmftlnirrkpqvlaeasasqascfsdgyplpswtwkkcsdkspncteeitegvwnrkanrkvfgqwvssstlnmseaikgflvkccaynslgtscetillnspgpfpfiqdnisfyatigvcllfivvltllichkykkqfryesqlqmvqvtgssdneyfyvdfreyeydlkwefprenlefgkvlgsgafgkvmnataygisktgvsiqvavkmlkekadsserealmselkmmtqlgshenivnllgactlsgpiylifeyccygdllnylrskrekfhrtwteifkehnfsfyptfqshpnssmpgsrevqihpdsdqisglhgnsfhsedeieyenqkrleeeedlnvltfedllcfayqvakgmeflefkscvhrdlaarnvlvthgkvvkicdfglardimsdsnyvvrgnarlpvkwmapeslfegiytiksdvwsygillweifslgvnpypgipvdanfykliqngfkmdqpfyateeiyiimqscwafdsrkrpsfpnltsflgcqladaeeamyqnvdgrvsecphtyqnrrpfsremdlgllspqaqveds(seqidno:85)

car信号肽dna

atggcactccccgtaactgctctgctgctgccgttggcattgctcctgcacgccgcacgcccg(seqidno:86)

car信号肽：malpvtalllplalllhaarp(seqidno:87)

scfvg4s连接子dna

ggcggtggaggctccggaggggggggctctggcggagggggctcc(seqidno:88)

scfvg4s连接子：ggggsggggsggggs(seqidno:89)

scfvwhitlow连接子dna

gggtctacatccggctccgggaagcccggaagtggcgaaggtagtacaaagggg(seqidno:90)

scfvwhitlow连接子：gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:91)

4-1bb核酸序列(细胞内域)

aagcgcggcaggaagaagctcctctacatttttaagcagccttttatgaggcccgtacagacaacacaggaggaagatggctgtagctgcagatttcccgaggaggaggaaggtgggtgcgagctg(seqidno:92)

4-1bbaa(细胞内域)

krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:93)

ox40aa

rrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki(seqidno:94)

以引用方式并入

本说明书中提及的所有公开案、专利及专利申请均以引用的方式并入本文，达到如同明确及个别地指示将各个个别公开案、专利或专利申请以引用的方式并入的相同程度。然而，本文对参考文献的引用不应解释为承认此类参考文献为本发明的先前技术。在以引用的方式并入的参考文献中所提供的任何定义或术语与在本文中所提供的术语及讨论不同的情况下，以本发明术语及定义为准。

等效物

认为前述书面说明是足以能够使所属领域技术人员来实践本发明。前述描述及实例详述本发明的某些优选实施方案，且描述由发明人所考虑的最佳模式。然而，应当理解，无论前述以文本形式表达得如何详细，本发明仍可以许多方式实践，且应根据随附权利要求及其任何等效物解释本发明。

仅出于说明目的提供以下实施例(包括进行的实验及达到的结果)且其不欲解释为限制本发明。

实施例1

将namalwa、mv4；11和hl60细胞(atcc)以及eol1细胞(sigma-aldrich)培养于rpmi1640(lonza)+10％fbs(corning)+1x青霉素链霉素l-谷氨酰胺(corning)(r10)培养基中，且维持在0.5至2.0x106个细胞/ml的细胞密度。为了检查细胞表面flt3表达，将细胞在4℃下用抗flt3抗体(bdpharmingen)或igg1同种型对照抗体(bdpharmingen)于染色缓冲液(bdpharmingen)中培育30分钟。然后将细胞洗涤且重悬于具有碘化丙啶(bdpharmingen)的染色缓冲液中，之后进行数据收集。靶细胞上的flt3表达显示于图1中。

实施例2

通过用ecori及bamhi(neb)隔夜消化10μgdna，将编码t7启动子、car构建体和β球蛋白稳定序列的质粒线性化。然后将dna在50℃下用经苯酚/氯仿纯化的蛋白酶k(thermofisher,600u/ml)消化2小时，且通过加入乙酸钠及两体积的乙醇来沉淀。然后将团块干燥，重悬于不含rnase/dnase的水中，且使用nanodrop定量。然后按照制造商的说明书，使用mmessagemmachinet7ultra(thermofisher)将1μg线性dna用于体外转录。将rna按照制造商的说明书使用megaclearkit(thermofisher)进一步纯化，且使用nanodrop定量。使用在琼脂糖凝胶上的迁移率评估mrna完整性。根据制造商的说明书，使用ficoll-paque密度离心从健康供体leukopak(hemacare)中分离pbmc。在r10培养基+il-2(300iu/ml,therapeuticsanddiagnostics)中使用okt3(50ng/ml,miltenyibiotec)刺激pbmc。刺激后7天，将t细胞在opti-mem培养基(thermofisherscientific)中洗涤两次，且以2.5x107个细胞/ml的最终浓度重悬于opti-mem培养基中。每次电穿孔使用10μgmrna。使用geminix2系统(harvardapparatusbtx)执行细胞的电穿孔以在2mm比色杯(harvardapparatusbtx)中递送单个400v脉冲持续0.5ms。将细胞立即转移至r10+il-2培养基，且使其恢复6小时。为了检查car表达，将t细胞在4℃下在染色缓冲液(bdpharmingen)中用flt-＝3-his(sinobiological公司)或生物素化蛋白l(thermoscientific)染色30分钟。然后将细胞洗涤，且在4℃下在染色缓冲液中用抗his-pe(miltenyibiotec)或pe链霉抗生物素蛋白(bdpharmingen)染色30分钟。然后将细胞洗涤且重悬于具有碘化丙啶(bdpharmingen)的染色缓冲液中，之后进行数据收集。经电穿孔的t细胞中flt3car的表达显示于图2中。

实施例3

为了检查经电穿孔的flt3cart细胞中的溶细胞活性，将效应细胞与靶细胞以1:1e:t比率培养于r10培养基中。共培养后16小时，通过luminex(emdmillipore)分析上清液，且通过流式细胞术分析cd3-阴性细胞的碘化丙啶(pi)摄取评估靶细胞活力。经电穿孔的cart细胞的溶细胞活性显示于图3中，且细胞因子产生显示于图4中。

实施例4

将含有不同car构建体的第三代慢病毒转移载体连同virapowerlentiviralpackagingmix(lifetechnologies)一起使用以产生慢病毒上清液。简言之，通过将15μgdna及22.5μl聚乙烯亚胺(polyethileneimine)(polysciences,1mg/ml)在600μloptimem培养基中混合来产生转染混合物。在室温下，将混合物培育5分钟。同时，对293t细胞(atcc)进行胰蛋白酶消化、计数，且将总计10x106个总细胞连同转染混合物一起铺板于t75烧瓶中。转染后三天，将上清液收集且通过0.45μm过滤器过滤，且在-80℃下储存直至使用。根据制造商的说明书，使用ficoll-paque密度离心从健康供体leukopak(hemacare)中分离pbmc。在r10培养基+il-2(300iu/ml,therapeuticsanddiagnostics)中使用okt3(50ng/ml,miltenyibiotec)刺激pbmc。刺激后48小时，在moi＝10下使用慢病毒转导细胞。将细胞维持在0.5至2.0x106个细胞/ml，之后用于活性分析中。为了检查car表达，将t细胞在4℃下在染色缓冲液(bdpharmingen)中用flt-3-his(sinobiological公司)或生物素化蛋白l(thermoscientific)染色30分钟。然后将细胞洗涤，且在4℃下在染色缓冲液中用抗his-pe(miltenyibiotec)或pe链霉抗生物素蛋白(bdpharmingen)染色30分钟。然后将细胞洗涤且重悬于具有碘化丙啶(bdpharmingen)的染色缓冲液中，之后进行数据收集。来自两个健康供体的t细胞中flt3car的表达显示于图5中。

实施例5

为了检查经慢病毒转导的flt3cart细胞中的溶细胞活性，将效应细胞与靶细胞以1:1e:t比率培养于r10培养基中。共培养后16小时，通过luminex(emdmillipore)分析上清液，且通过流式细胞术分析cd3-阴性细胞的碘化丙啶(pi)摄取评估靶细胞活力。来自两个健康供体的经慢病毒转导的cart细胞的平均溶细胞活性显示于图6中，且来自各健康供体的cart细胞的细胞因子产生显示于图7中。

实施例6

为了评估响应于表达flt3的靶细胞的cart细胞增殖，将t细胞用cfse标记，之后与靶细胞以1:1e:t比率共培养于r10培养基中。五天后，通过流式细胞术分析cfse稀释物评估t细胞增殖。flt3cart细胞的增殖显示于图8中。

实施例7

为了检查体内抗白血病活性，产生flt3cart细胞，以用于人aml的异种模型中。人aml的异种模型中所使用的各种效应细胞系(effectorline)的car表达显示于图9中。将经荧光素酶标记的mv4；11细胞(2x106个/动物)静脉内注射至5至6周龄雌性nsg小鼠中。6天后，静脉内注射含6x106个t细胞(约50％car+)的200μlpbs，且每周使用生物发光成像测量动物的肿瘤负荷(tumorburden)。如图10中所示，注射表达10e3-cd28t及8b5-cd28t的cart细胞显著减少在所有时间点检查的的肿瘤负荷。如图11中所示，此情况用存活分析进一步证实，其中注射表达10e3-cd28t或8b5-cd28t的cart细胞赋予优于接受经模拟转导的细胞或表达10e3-cd28或10e3-cd8构建体的cart细胞的动物的显著的存活优势。就功效而言，在10e3-cd28t与8b5-cd28t构建体之间未观察到显著差异。