本发明涉及一种ugt1a1基因的快速扩增试剂盒及扩增方法，属于生物检测领域。
背景技术：
：伊立替康(irinotecan，cpt-11)是半合成水溶性喜树碱衍生物，主要作用于细胞周期的s期，抑制dna单链断裂后的修复，干扰dna复制和转录，从而发挥细胞毒效应，对转移性结直肠癌、肺癌等多种肿瘤有效，目前广泛应用于胃肠癌和小细胞肺癌的治疗。伊立替康在人体组织内被羧酸酯酶(carboxylesterases，ce)水解转化为7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin，sn-38)，sn-38为dna拓扑异构酶ⅰ(topoⅰ)抑制剂，cpt-11及sn-38作用于细胞周期s期，通过抑制topoⅰ，诱导dna单链损伤、阻断dna复制而产生细胞毒效应。但伊立替康临床应用中可能发生骨髓抑制及延迟性腹泻等严重不良反应，且个体差异明显，因此在临床应用中受限。迟发性腹泻和中性粒细胞减少是伊立替康的剂量限制性毒性，两者发生率分别可达到约30％和46％，甚至可导致患者死亡。药物代谢的遗传多态性是造成个体间不良反应差异的主要因素之一。尿苷二磷酸葡糖醛酰转移酶(ugts)是一大类能催化葡萄糖醛酸与亲核底物结合的膜结合酶，主要存在于肝脏，能够催化多种内源性和外源性的可溶性脂质葡糖醛酸化，增加底物的极性，使其更好的被体内清除。人类的ugts分为ugt1、ugt2两个家族，ugt1的基因至少包括13个亚型：ugt1a1、ugt1a2～ugt1a12。目前大量研究证实尿苷二磷酸葡糖苷酸转移酶1a1(ugt1a1)是sn-38体内代谢失活的关键酶，使sn-38转变为糖基化sn-38(sn-38g)，使sn-38转变为糖基化sn-38(sn-38g)，从而经尿液、胆汁排出。ugt1a1酶的功能及其基因多态性(snp)与伊立替康的毒性有着密切关系。已有研究发现ugt1a1由于基因多态性的变化，表达是高度可变的，不同患者之间的sn-38糖化反应的速率相差最高达50倍。ugt1a1含30多个基因变异体，其中很多都可影响酶的功能和分布，ugt1a1*28是目前报道最多的ugt1a1基因变异体。ugt1a1基因启动子区具有一定多态性，其不典型tata盒区域中包含了5-8个ta重复序列，野生型ugt1a1*1为6个ta重复序列，即(ta6/6或*1/*1)，最为常见，变异型ugt1a1*28为7个ta重复序列，包括纯合突变型(ta7/7或*28/*28)和杂合突变型(ta6/7或*1/*28)，该变异型与可影响ugt1a1表达，与伊立替康化疗所致的严重血液毒性及迟发性腹泻有关。此外，ugt1a1*6在第一外显子211位的单核苷酸多态性形成3中基因型：g/g、a/g、a/a，且该变异只在亚洲人基因的编码区发现，并已证实能降低ugt的酶活。由于多态性带来的伊立替康的差异性不良反应，因此在临床使用伊立替康时，一般建议先对ugt1a1进行检测，便于确认是否使用该药会引起严重的不良反应。但现有的ugt1a1检测是基于常规基因检测手段进行检测的，检测周期长、成本高，不利于用药前的快速鉴定，因此，开发一款操作简单、价格低廉的针对ugt1a1的快速扩增诊断试剂盒是十分必要的。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以ugt1a1的现有检测手段为基础，获得一种ugt1a1基因的快速扩增试剂盒及扩增方法。为实现上述发明目的之一，本发明采用的ugt1a1基因的快速扩增试剂盒的技术方案如下：本发明的ugt1a1基因的快速扩增试剂盒由ugt1a1*6扩增组和ugt1a1*28扩增组组成，本试剂盒对待扩增样本的ugt1a1*6和ugt1a1*28两个基因进行定向扩增，其中ugt1a1*6扩增组包括扩增ugt1a1*6片段的特异性引物，ugt1a1*28扩增组包括扩增ugt1a1*28片段的特异性引物。特异性引物根据人类ugt1a1基因的基因型进行设计，ugt1a1*6扩增组的目的基因片段如序列表seqidno：1所示，ugt1a1*28扩增组的目的基因片段如序列表seqidno：2所示。特异性扩增ugt1a1*6是上下游引物的基因序列如序列表seqidno：3和序列表seqidno：4所示，上游(正向)引物如序列表seqidno：3所示，下游(反向)引物如序列表seqidno：4所示。特异性扩增ugt1a1*28是上下游引物的基因序列如序列表seqidno：5和序列表seqidno：6所示，上游(正向)引物如序列表seqidno：5所示，下游(反向)引物如序列表seqidno：6所示。本发明中的快速扩增试剂盒基于ugt1a1基因中对于伊立替康药物临床使用最重要的两个位点进行扩增，针对扩增结果，可同时对ugt1a1*6基因和ugt1a1*28基因进行测序，两个位点的测序结果联合形成检测结果，相比于以往的单基因扩增结果来说，对于临床学的使用价值更大，且更为准确。同一体系中对两段目的基因同时进行扩增，不仅更加高效准确，并且大大减少了扩增试剂的使用、缩小了扩增体系的体积，高效扩增的同时，满足了绿色节约的需要，降低了扩增成本，为基因测序的广泛普及提供了新思路。优选的，待扩增的模板dna为提取自人血样本的人全血模板dna。根据现有的样本处理方式，人血样本或口腔拭子居多，这二者一般均采用蛋白酶消化的方式进行dna提取，提取后的dna样本用途广泛。本试剂盒一般采用的是消化提取后的dna模板，由于扩增条件的要求较高，不建议使用市售的全血样品扩增缓冲液直接进行扩增。提取dna模板的方法或设备可以参考现有技术，在此不做限制。优选的，ugt1a1*6扩增组和ugt1a1*28扩增组均包括特异性引物、dna聚合酶、dntps和扩增缓冲液(pcrbuffer)，为了保证试剂盒的扩增效果，扩增试剂盒中还包括dmso和牛血清蛋白(bsa)，使用时需自备灭菌超纯水。更优选的，dna聚合酶为热启动taq酶。热启动taq酶相比于一般的dna聚合酶使反应体系更加灵敏，可以根据不同温度对不同的片段进行延伸，有效的避免了pcr的非特异性扩增，使本发明中的两重pcr的结果更好，同时也为两重以上的多重pcr提供了一个酶系的优选方案。本发明的另一个发明目的在于提供一种采用上述快速扩增试剂盒的扩增方法，所述扩增方法采用同一体系中温度梯度扩增多个片段的扩增方法，同时扩增体系中共存的ugt1a1*6模板和ugt1a1*28模板，即模板dna在同一温度变性后，先降至一较高的退火温度，退火后再降温至较低的退火温度，也就是ugt1a1*6模板先退火，退火完成后ugt1a1*28模板再退火，退火完成后同一温度下同时延伸，20～35个循环后结束扩增。优选的，本方法中的扩增条件具体为：初始变性(预变性)94℃保持5min，变性94℃30s，65℃退火2min，再降温至53℃，退火2min，72℃延伸1min，30个循环。优选的，本扩增条件选择的扩增体系为：模板dna150ng；1×pcrbuffer；cheetahtaq热启动酶1u；dntps各200μm；5％dmso；正向和反向引物各0.4μmol；1％bsa0.05μl；灭菌的超纯水补足25μl。本发明的扩增方法中为了保证扩增结果，在扩增体系中加入了dmso和bsa，但这两者是可以在一定条件下调整用量或不添加的，添加剂的使用仅为本发明的一种优选的实施方案，不应由于本扩增体系中的dmso和bsa的存在和用量对本发明的保护范围进行限制。由于特异性引物的发现及扩增体系的建立，本发明还公开了一种ugt1a1基因的特异性引物在快速扩增试剂盒中的应用，所述试剂盒用于同时在同一体系中扩增ugt1a1基因的ugt1a1*6基因型和ugt1a1*28基因型。本试剂盒中的扩增的ugt1a1*6基因片段和ugt1a1*28基因片段可以作为基因筛查、疾病易感性、用药指导等多方面的进一步鉴定和诊断依据，对于该基因的研究和临床发展具有重要的意义。扩增后扩增产物的鉴定和测序等下游实验步骤可参照现有技术进行，在此不做赘述。与现有技术相比，本发明采用多重pcr的方法，同时对ugt1a1*6和ugt1a1*28的基因多态性位点进行扩增，扩增体系稳定高效，可以快速准确地同时扩增需要检测的ugt1a1*6和ugt1a1*28位点，扩增引物特异性高、产物完整，为后期基因测序提供了良好的基础。快速扩增两个对亚洲人具有重要意义的位点，其检测结果对于伊立替康的用药具有决定性的指导作用，本试剂盒检测的位点可以作为伊立替康用药检测的独立危险因子，使用本试剂盒检测结果准确，检测过程快速，操作简单，检测结果可以用于多种科研及临床医疗，具有良好的推广价值。附图说明图1是本发明提供的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的ugt1a1基因的快速扩增试剂盒及扩增方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。本发明的试剂盒中包括ugt1a1的ugt1a1*6扩增组和ugt1a1*28扩增组，其中ugt1a1*6扩增组和ugt1a1*28扩增组的区别仅在于扩增引物和测序引物的不同。ugt1a1*6扩增组包括：ugt1a1*6扩增引物、dna聚合酶、扩增缓冲液、dntps和mg2+。ugt1a1*28扩增组包括：ugt1a1*28扩增引物、dna聚合酶、扩增缓冲液、dntps和mg2+。ugt1a1*6扩增组和ugt1a1*28扩增组中相同的试剂可以混用，对上述两个位点进行单独扩增检测或同时扩增检测。本发明采用美国mjresearch公司的ptc-255pcr扩增仪进行特异性快速扩增，扩增体系为25μl体系。本实施例采用的样品来自武汉市中心血站，经过人血样品dna提取后进行实验。一、dna提取提取dna可采用现有技术或市售试剂盒进行，本实施例中的提取步骤如下：1)取400μl全血于2ml离心管中，加入410μlste溶液、90μl10％异丙醇(sds)溶液及10μl蛋白酶k于离心管中，轻轻摇晃2min混合均勾，置于65℃水浴锅中消化过夜；2)在充分消化的血样中加入300μl饱和nacl溶液后，轻轻颠倒混匀；3)加入400μl氯仿轻摇混勾，20℃，12000rpm离心20min；4)将上清液移至新的1.5ml离心管中，加入等体积的预冷(-20℃)的异丙醇混合均匀，4℃，12000rpm离心15min，弃掉上清液；5)加入预冷(-20℃)的75％乙醇溶液与离心管中洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心15min，弃掉上清液；6)重复步骤5)；7)室温条件下将沉淀晾干，加入100μlmili-q水溶解沉淀；8)取1μldna样本，采用1％琼脂糖凝胶电泳对样本的质量进行检测，并釆用紫外可见分光光度计测定样本纯度及浓度；用mili-q水将dna样本均稀释至10ng/μl备用。二、引物设计ugt1a1*6扩增组的目的基因片段如序列表seqidno：1所示，ugt1a1*6的rs号为4148323，序列长1001bp，第501位为ugt1a1*6的snp位点，r表示为a/g错配，具体序列如下，序列中下划线处为特异性引物结合位置：aatactaatttaatggatcctgaggttctggaagtactttgctgtgttcactcaagaatgtgatttgagtatgaaattccagccagttcaactgttgttgcctattaagaaacctaataaagctccaccttctttatctctgaaagtgaactccctgctacctttgtggactgacagctttttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgccatatatatatatataagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatggctgtggagtcccagggcggacgcccacttgtcctgggcctgctgctgtgtgtgctgggcccagtggtgtcccatgctgggaagatactgttgatcccagtggatggcagccactggctgagcatgcttggggccatccagcagctgcagcagaggggacatgaaatagttgtcctagcacctgacgcctcgttgtacatcagagacrgagcattttacaccttgaagacgtaccctgtgccattccaaagggaggatgtgaaagagtcttttgttagtctcgggcataatgtttttgagaatgattctttcctgcagcgtgtgatcaaaacatacaagaaaataaaaaaggactctgctatgcttttgtctggctgttcccacttactgcacaacaaggagctcatggcctccctggcagaaagcagctttgatgtcatgctgacggaccctttccttccttgcagccccatcgtggcccagtacctgtctctgcccactgtattcttcttgcatgcactgccatgcagcctggaatttgaggctacccagtgccccaacccattctcctacgtgcccaggcctctctcctctcattcagatcacatgaccttcctgcagcgggtgaagaacatgctcattgccttttcacagaactttctgtgcgacgtggtttattccccgtatgcaacccttgcctcagaattcugt1a1*28扩增组的目的基因片段如序列表seqidno：2所示，ugt1a1*28的rs号为8175347，序列长151bp，第76位为ugt1a1*28的snp位点，n表示为ta碱基的重复，具体序列如下，序列中下划线处为特异性引物结合位置：tttgtggactgacagctttttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgccanagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatggctgtggagtcccagggcggacgcccacttgtc根据上述基因序列，采用primerprimer5软件设计扩增引物和退火引物，引物序列具体如下：三、多重pcr扩增本实施例中的两个目的片段的扩增在同一个扩增体系中进行，扩增过程分为两个阶段，根据解链的温度不同，对两段dna进行同一体系内的扩增。扩增体系采用的试剂如下：10×pcrbuffer(500mmkcl，100mmtris-hcl，24℃时ph8.3，15mmmgcl2)；cheetahtaq热启动酶(biotium公司)；100mm母液的核苷酸(dntp)，其中分别含有25mm的datp、dctp、dgtp和dttp；二甲亚砜(dmso)、牛血清蛋白(bsa)、引物和模板dna。本实施例中的扩增体系为25μl体系，冰浴加样，体系中样品包括：模板dna150ng；1×pcrbuffer；cheetahtaq热启动酶1u；dntps各200μm；5％dmso；正向和反向引物各0.4μmol；1％bsa0.05μl；灭菌的超纯水补足25μl。以ugt1a1*6和ugt1a1*28的目标序列为模板，加入ugt1a1*6和ugt1a1*28的特异性上下游引物，并加入酶系及底物，冰浴构建扩增体系；以构建好扩增体系后，将扩增体系至于pcr扩增仪中进行快速扩增，扩增条件如下：初始变性(预变性)，94℃保持5min，变性94℃30s，65℃退火2min，再降温至53℃，退火2min，72℃延伸1min，30个循环。四、扩增结果验证扩增结束后，将扩增产物妥善保存，并与单独扩增的ugt1a1*6、ugt1a1*28目标序列进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。单独扩增的ugt1a1*6、ugt1a1*28目标序列与采用如序列表seqidno：3～6所示的引物，常规扩增体系和扩增条件进行扩增。在3％琼脂糖凝胶电泳，低电场下，电泳结果如图1所示。图中m表示dnamarker，条带1为本实施例中的扩增产物，条带2为ugt1a1*6的扩增产物，条带3为ugt1a1*28的扩增产物。五、扩增结果测序将本实施例中的扩增结果送检测序，测序结果与预期的序列完全相同，说明扩增体系准确有效。以300例中心血站的收集样品为例进行快速扩增，扩增后测序结果如下表1所示：根据扩增结果对扩增产物的测序结果进行总结，将检测样本分为野生型(ta6/6且g/g)、单点变异型(ta6/7且g/g、ta6/6且g/a)和双点变异型(ta6/7且g/a、ta7/7且g/g、ta6/6且a/a)三类，分类后的具体结果如下表2所示：检出人数百分比(％)野生型12842.7单点变异型15250.7双点变异型206.7根据现有的实验数据和文献记载，ugt1a1*6和ugt1a1*28基因型均为野生型的人群对伊立替康的不良反应明显低于单点变异和双点变异的人群。本实施例中的试剂盒可以快速准确地对ugt1a1*6和ugt1a1*28两个基因进行同时扩增，对扩增产物进行测序后，可以同时得到两个位点的基因型，两个位点的结果进行综合考虑，使得ugt1a1基因的检测结果更加准确，辅助判断的作用更加直接。最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。序列表<110>新开源禄西（南京）生物科技有限公司<120>一种ugt1a1基因的快速扩增试剂盒及扩增方法<130>2017<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1001<212>dna<213>homosapiens<220><221>gene<222>(1)..(1001)<223>ugt1a16基因序列<400>1aatactaatttaatggatcctgaggttctggaagtactttgctgtgttcactcaagaatg60tgatttgagtatgaaattccagccagttcaactgttgttgcctattaagaaacctaataa120agctccaccttctttatctctgaaagtgaactccctgctacctttgtggactgacagctt180tttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgccatat240atatatatataagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatggctgtgg300agtcccagggcggacgcccacttgtcctgggcctgctgctgtgtgtgctgggcccagtgg360tgtcccatgctgggaagatactgttgatcccagtggatggcagccactggctgagcatgc420ttggggccatccagcagctgcagcagaggggacatgaaatagttgtcctagcacctgacg480cctcgttgtacatcagagacrgagcattttacaccttgaagacgtaccctgtgccattcc540aaagggaggatgtgaaagagtcttttgttagtctcgggcataatgtttttgagaatgatt600ctttcctgcagcgtgtgatcaaaacatacaagaaaataaaaaaggactctgctatgcttt660tgtctggctgttcccacttactgcacaacaaggagctcatggcctccctggcagaaagca720gctttgatgtcatgctgacggaccctttccttccttgcagccccatcgtggcccagtacc780tgtctctgcccactgtattcttcttgcatgcactgccatgcagcctggaatttgaggcta840cccagtgccccaacccattctcctacgtgcccaggcctctctcctctcattcagatcaca900tgaccttcctgcagcgggtgaagaacatgctcattgccttttcacagaactttctgtgcg960acgtggtttattccccgtatgcaacccttgcctcagaattc1001<210>1<211>151<212>dna<213>homosapiens<220><221>gene<222>(1)..(151)<223>ugt1a128基因序列<220><221>misc_feature<222>(76)..(76)<223>nisa,c,g,toru<400>1tttgtggactgacagctttttatagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatc60gattggtttttgccanagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatggc120tgtggagtcccagggcggacgcccacttgtc151<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>ugt1a16基因正向引物序列<400>3gttgtcctagcacctgacgcct22<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>ugt1a16基因反向引物序列<400>4agccagacaaaagcatagcagagt24<210>5<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>ugt1a128基因正向引物<400>5cacgtgacacagtcaaaca19<210>6<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>ugt1a128基因反向引物<400>6ctttgctcctgccagaggt19当前第1页12