本发明涉及微生物技术领域，进一步涉及益生菌的生理学应用及肿瘤的治疗，具体涉及一种配合CART细胞治疗的复合益生菌菌剂、其制备方法及用途。
背景技术：
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，投入后改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，提高宿主健康水平和使宿主健康达到最佳状态。迄今为止，科学家已发现的益生菌大体上可分成三大类，其中包括：乳杆菌类、双歧杆菌类、革兰氏阳性球菌，此外，还有一些酵母菌与酶亦可归入益生菌的范畴。益生菌的作用主要可以概括为：预防或改善腹泻、缓解不耐乳糖症状、预防生殖系统感染、增强人体免疫力、促进肠道消化系统健康、降低血清胆固醇、预防骨质疏松症、帮助吸收营养成分等。尽管在维持肠道的正常环境中具有重要作用，但肠道益生菌能否对其他食源性疾病起到预防或治疗作用，现有技术中仍缺乏成熟的研究，在这种情况下，有必要进一步探索益生菌对人体其他生理作用的影响，进而挖掘其深层次的药物用途。
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CART)治疗是一种肿瘤特异性T细胞治疗，CART技术是把识别肿瘤细胞特异靶点的功能基因通过基因工程法改造患者的T淋巴细胞，让T细胞能够识别肿瘤细胞，成为肿瘤特异性T细胞用于肿瘤治疗。其中识别CD19靶点的CART可以治愈B淋巴细胞白血病和淋巴瘤,FDA可能在一两年后批准上市。由于CART技术在血液肿瘤的成功应用，以及技术本身的应用广泛性，将来可以推广应用到其他血液肿瘤和实体瘤上。因此，CART细胞治疗被称为第三代细胞治疗。然而CART细胞的治疗效应常常伴随明显的毒副反应，其中最常见的有3种:细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、中枢神经系统病变及B细胞耗竭。细胞因子释放综合征(CRS)最早发现于单克隆抗体输注，以大量非抗原特异性炎症反应为特征，是CART细胞使用中发生的最严重的不良反应。CRS的发生是由于CART细胞在体内扩增时诱导参与肿瘤免疫的细胞表达细胞因子，并且导致TNF-α、IL-2、IL-6、IL-13和IFN-γ等炎症因子的释放。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种配合CART细胞治疗的复合益生菌菌剂、其制备方法及用途，以解决现有技术的肿瘤CART细胞治疗过程中毒副作用严重的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中单纯的肿瘤CART细胞治疗方法疗效有待提升。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种配合CART细胞治疗的复合益生菌菌剂，由活菌数比为1:1:1:1:1的嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、长双歧杆菌、谢曼氏丙酸杆菌、胚牙乳杆菌组成；所述复合益生菌菌剂中活菌数量为109～1010个/g。
同时，本发明提供了一种上述复合益生菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)选菌活化：选取五种益生菌分别进行培养基活化；
2)混合离心：将步骤1)所得菌液按1:1:1:1:1的体积比混合后离心取菌体；
3)冻干：向步骤2)所得菌体中加入冻干粉保护剂，在冻干机中冻干。
作为优选，还包括以下步骤4)：加入奶粉并进行分装。
作为优选，步骤1)具体包括以下操作：取嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、长双歧杆菌、谢曼氏丙酸杆菌、胚牙乳杆菌的菌种，各自按培养基体积的5％分别接种于5mL MRS培养基中，于37℃恒温培养箱中培养过夜；分别取培养所得的五种菌液，各自按培养基体积的5％分别接种5mL MRS培养基中，二次活化；活化至PH＝4.2时终止。
作为优选，步骤3)中所述的冻干保护剂含有质量分数为10％的脱脂乳、质量分数为6％的海藻糖、质量分数为2％凝胶。
作为优选，步骤3)中加入的冻干保护剂总质量与菌体总质量相等。
作为优选，还包括以下步骤5)：步骤4)所得产物，加生理盐水按10～106比例稀释，取50μL涂平板，过夜培养，进行活菌计数。
同时，本发明提供了上述复合益生菌菌剂用于制备缓解CART细胞治疗患者不良反应的药物的用途。
本发明提供了一种用于肿瘤靶向治疗的复合益生菌菌剂及其制备方法，该技术方案首先考察了CART细胞治疗过程中患者生理过程的变化以及不良反应的成因，进而有针对性的选择了对不良反应具有改善作用的益生菌。在此基础上，基于各类益生菌的生理作用及其协同关系选择了嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、长双歧杆菌、谢曼氏丙酸杆菌、胚牙乳杆菌作物菌剂主体，并从用量配比、活菌数量等角度设计了复配方案。本发明所提供的益生菌菌剂不仅对CART治疗期间患者的不良反应具有明显的缓解作用，同时可以增强机体的免疫功能，抑制致癌物质，影响肿瘤细胞的基因表达，对肿瘤具有拮抗作用。而且可以增强肠道粘膜的屏障作用、刺激免疫细胞产生各种细胞因子(如促炎因子IL-12、IFN-γ、TNF-α、抗炎因子IL-10)、增强吞噬细胞的吞噬活性等,促进机体的非特异性免疫，从而调控炎症反应。
综合来看，本发明具有如下优势：
1)大部分细菌都具有一定毒性，在作为治疗剂使用时必须先剔除毒性基因进行减毒才能应用，而益生菌对人体安全无毒，可直接应用；
2)益生菌增强机体的免疫功能，抑制致癌物质，影响肿瘤细胞的基因表达，对肿瘤具有拮抗作用。
3)益生菌可以增强肠道粘膜的屏障作用、刺激免疫细胞产生各种细胞因子(如促炎因子IL-12、IFN-γ、TNF-α、抗炎因子IL-10)、增强吞噬细胞的吞噬活性等，促进机体的非特异性免疫，从而调控炎症反应。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
一种配合CART细胞治疗的复合益生菌菌剂，由活菌数比为1:1:1:1:1的嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、长双歧杆菌、谢曼氏丙酸杆菌、胚牙乳杆菌组成；所述复合益生菌菌剂中活菌数量为109个/g。
一种上述复合益生菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)选菌活化：选取五种益生菌分别进行培养基活化；
2)混合离心：将步骤1)所得菌液按1:1:1:1:1的体积比混合后离心取菌体；
3)冻干：向步骤2)所得菌体中加入冻干粉保护剂，在冻干机中冻干。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
还包括以下步骤4)：加入奶粉并进行分装。
步骤1)具体包括以下操作：取嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、长双歧杆菌、谢曼氏丙酸杆菌、胚牙乳杆菌的菌种，各自按培养基体积的5％分别接种于5mLMRS培养基中，于37℃恒温培养箱中培养过夜；分别取培养所得的五种菌液，各自按培养基体积的5％分别接种5mL MRS培养基中，二次活化；活化至PH＝4.2时终止。
步骤3)中所述的冻干保护剂含有质量分数为10％的脱脂乳、质量分数为6％的海藻糖、质量分数为2％凝胶。
步骤3)中加入的冻干保护剂总质量与菌体总质量相等。
还包括以下步骤5)：步骤4)所得产物，加生理盐水按10～106比例稀释，取50μL涂平板，过夜培养，进行活菌计数。
上述复合益生菌菌剂用于制备缓解CART细胞治疗患者不良反应的药物的用途。
实施例2
一种配合CART细胞治疗的复合益生菌菌剂，由活菌数比为1:1:1:1:1的嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、长双歧杆菌、谢曼氏丙酸杆菌、胚牙乳杆菌组成；所述复合益生菌菌剂中活菌数量为1010个/g。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。