本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种一步式胚胎培养液及其制备方法。
背景技术：
：体外受精-胚胎移植invitrofertilization-embryotransfer简称ivf-et，是指分别将卵子与精子取出后，体外受精，再将胚胎前体——受精卵移植回母体子宫内发育成胎儿。试管婴儿是用人工方法让卵子和精子在体外受精并进行早期胚胎发育，然后移植到母体子宫内发育而诞生的婴儿。自从世界上第一个“试管”婴孩于1978年7月25日在英国出生后，到2012年7月1日已有500万个“试管”婴孩诞生。ivf为全球超过占5000万不孕症夫妇带来了福音。然而，三十多年的临床实践并没有显著提高ivf的成功率。2011年，美国妊娠协会统计35岁病人ivf成功率(受孕率)在25-30％左右，而1997年也在30％左右，而婴儿出生率更低。其中一个重要的原因是ivf胚胎培养液的质量，这是ivf胚胎质量最重要的决定性因素之一。ivf培养通常分为两种流程即两种培养液系列：全程(单/一步式培养液系列)和分程(双培养液系列)。利用双培养液系列流程对胚胎早期和后期阶段提供不同的培养液成份，但也丢失了由胚胎分泌入培养液中的重要的有效成份，如胚胎营养因子。全程培养液系列流程保留了这些重要的有效成份，但也保留了培养液中有害的分解产物。目前使用的受精液调配的营养不全，或其物理或化学指标过余宽，同样的试验过程、同批次精液在培养过程中容易使精子或卵细胞死亡、或精子获能不足活力较低、或卵细胞生存受到影响，如在精子活力试验中，精子保持活力的比率较低，或其比率接近或低于合格标准(保持活力率≥75％)。有些受精液的稠度较高，其含有有害成份和炎细胞去除不干净，严重影响受精卵的发育成长。另外，一般培养液在使用前不能直观地判断有效性的好坏，如果在其变质后仍继续使用将对试验或临床操作造成不可逆转的结果。因此需要开发一种无需更换培养液、含有重要有效成分并能抑制有害产物的一步式胚胎培养液。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于制备一步式胚胎培养液的组合物及一步式胚胎培养液，本发明的一步式胚胎培养液保留了胚胎分泌入培养液中的有效成分，能起到保护细胞并抑制分解利用有害产物的作用。为实现上述目的，本发明的技术方案为：用于制备一步式胚胎培养液的组合物，所述组合物由(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸组成；所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸的摩尔比为0.055-0.098：0.044-0.078：0.702-0.858。关键物料a：(±)-α-硫辛酸α-硫辛酸(la)以闭环二硫化物形式和开链还原形式两种结构混合物存在，这两种形式通过氧化-还原循环相互转换，像生物素一样，硫辛酸事实上常常不游离存在，而是以其羧基同酶分子(如二氢硫辛酸乙酰转移酶)中赖氨酸残基的ε-nh2基以酰胺键共价结合(结构上与生物胞素十分相似)。硫辛酸享有“万能抗氧化剂”之称，在生物体内广泛存在，是一种具有广泛生物学活性的二硫化合物，具有很强的抗氧化活性，la可以清除体内氧自由基，螯合金属离子，再生体内其他抗氧化剂来发挥抗氧化作用，保护线粒体功能、调节能量代谢。其中活性氧(reactiveoxidativespecies，ros)/氧自由基导致的氧化应激对男性睾丸和精子的损伤可能是男性不育的原因之一。la在生物体内可以转化为还原型的dhla，两者共同作用，几乎能清除生殖系统中所有的ros及自由基，如单线态氧、羟基自由基、过氧化氢、过氧化亚硝基、一氧化氮和次氯酸等。对于轻度的氧化损伤，维生素c(vitaminc，vitc)、维生素e(vitamine，vite)和la均可修复，但重度的氧化损伤只有维生素e和la有效，尤其是la，不仅能修复重度氧化损伤，而且能够抵抗长时间、持续性的氧化损伤。机体的抗氧化防御系统主要由la、vitc、vite、辅酶q10、谷胱甘肽(gsh)5种抗氧化剂构成。la(包括dhla)是唯一能够使该系统中所有的抗氧化剂包括la自己，被再生为还原型抗氧化剂，从而激活生物体内其他抗氧剂的代谢循环，形成独特的抗氧化剂再生循环网络，共同发挥生物抗氧化作用，维持机体正常的氧化-抗氧化动态平衡。螯合金属离子睾丸是重金属的重要靶器官之一，对人体毒害最大的重金属主要为铅、汞、铬、砷、镉5种，镉是已知的最容易在体内蓄积的毒物，排出速度慢，慢性积累可直接破坏睾丸细胞dna结构并抑制其修复，催化产生的大量自由基，易引发睾丸与精子细胞膜脂质过氧化等严重的生殖损伤。la和dhla可以在体内外螯合多种重金属离子，如铜、锌、铅、砷、镉等金属离子。线粒体是细胞生命活动的控制中心，是细胞内能量转换体系和供能中心，且参与一般抗氧化防御及细胞凋亡等重要生理过程的调控。精子运动所需能量来自糖酵解和线粒体呼吸代谢中产生的atp，所以各种原因导致的线粒体结构和功能改变均可导致线粒体能量合成障碍，精子活力降低。la被称为线粒体营养素，即可保护线粒体酶、减少线粒体ros的产生或清除过量的ros、诱导ⅱ相酶增强细胞抗氧化能力、修复线粒体。关键物料b：乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐是左旋肉碱的酯化物，它呈白色粉末，易溶于水，不溶于丙酮。乙酰l-肉碱是存在于体内的一种自然物质，尤其在肌肉、大脑及精子中含量特别丰富，在人体内参与一系列重要的代谢过程，它从细胞中带走乙酰基并协助能量转移。乙酰l-肉碱在中枢神经系统和男性生殖中起到重要作用。乙酰l-肉碱的主要作用：①转运脂肪酸进入线粒体并在此进行b-氧化；②保护细胞：将过量的脂酰辅酶a排除体外防止其损坏细胞；③防止乳酸积累。激烈运动后产生大量乳酸，左旋肉碱可减少乳酸生成量，提高运动耐力；同时，它还有促进碳水化合物等物质能量利用，提高精子数目和活力等作用。乙酰l-肉碱可防止细胞质中脂肪酸和线粒体中乙酰辅酶a的毒性积累，同时为线粒体中能量的产生提供足够的乙酰辅酶a。乙酰l-肉碱及其盐酸盐具有多种生理活性，包括营养作用，神经保护作用，周围神经系统的止痛作用，促进能量代谢以及将长链脂肪酸转运至线粒体内膜参与氧化磷酸化并产生atp供能，调节病理条件下的抗氧化酶类发挥抗氧化作用以及在男性生殖系统中的作用等。关键物料c：n-乙酰基-l-半胱氨酸n-乙酰基-l-半胱氨酸能与亲电子的氧化基团直接发生作用的自由巯基(亲核的-sh)而发挥直接抗氧化作用，其分子结构使它易于透过细胞膜，是一种合成谷胱甘肽(gsh)的必需氨基酸。谷胱甘肽是细胞内最重要的保护剂，对保持细胞功能和细胞形态的完整性是必需，它可防止细胞免受体内外的氧自由基和各种细胞毒素物质的损害。n-乙酰基-l-半胱氨酸在保持适当的gsh水平方面起着重要作用，从而有助于保护细胞不因体内gsh水平过低而导致的细胞毒素损害。进一步，所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸的摩尔比为0.065-0.098：0.054-0.078：0.752-0.858。作为一种优选，所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸的摩尔比为0.065-0.0875：0.064-0.078：0.752-0.805。作为一种优选，所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸的摩尔比为0.078：0.078：0.782。(±)-α-硫辛酸含量过低导致胚胎发育过程出现中毒现象，胚胎形成率低，形态差等现象；如果过高导致胚胎无法正常分裂并死亡。乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐含量过低导致胚胎发育后期细胞裂解，过高导致胚胎活性低。n-乙酰基-l-半胱氨酸含量过低同样会导致细胞中毒现象，特别是培养后期，培养液粘稠，形态不完成。如果过高导致培养液渗透压偏大，细胞皱缩等现象。本发明的目的之二在于提供一种一步式胚胎培养液，由(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸和基本培养液组成，所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸和基本培养液的摩尔比为0.055-0.098：0.044-0.078：0.702-0.858：135.251-167.614。一步式胚胎培养液是指用于受精卵发育到囊胚的全程培养液，受精卵发育过程中无需更换培养液。相比于传统分程式培养液其优点是避免了胚胎移植过程中可能受到的机械损伤和培养环境不同造成的应激反应而导致的囊胚形成率不高的问题。作为一种优选，所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸和基本培养液的摩尔比为0.065-0.098：0.054-0.078：0.752-0.858：140.336-167.614。作为一种优选，所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸和基本培养液的摩尔比为0.065-0.0875：0.064-0.078：0.752-0.805：140.336-160.413。作为一种优选，所述(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱或乙酰l-肉碱盐酸盐、n-乙酰基-l-半胱氨酸和基本培养液的摩尔比为0.078：0.078：0.782：140.336-160.413。进一步，所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、d-山梨醇、人血清白蛋白和杀菌剂。作为一种优选，所述杀菌剂为庆大霉素。进一步，所述无机盐缓冲液、氨基酸、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、d-山梨醇的摩尔比为98.303-120.12:1.2-3.8:0.009-0.012:9.459-11.561:24.741-30.239:0.432-0.528:0.9-1.1:0.207-0.254。所述基本培养液的组成和配比配置的培养液囊胚形成率高，形态完整。作为一种优选，所述无机盐缓冲液、氨基酸、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、d-山梨醇的摩尔比为105.128-120.12:1.5-3.5:0.01-0.012:10.254-11.561:26.156-30.239:0.432-0.528:0.9-1.1:0.207-0.254。进一步，在100ml一步式胚胎培养液中所述人血清白蛋白的含量为0.45-0.55g/l；在100ml一步式胚胎培养液中杀菌剂的含量为45-55mg/l。作为一种优选，在100ml一步式胚胎培养液中所述人血清白蛋白的含量为0.48-0.53g/l；在100ml一步式胚胎培养液中杀菌剂的含量为48-53mg/l。作为一种优选，在100ml一步式胚胎培养液中所述人血清白蛋白的含量为0.5g/l；在100ml一步式胚胎培养液中杀菌剂的含量为50mg/l。进一步，所述无机盐缓冲液包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠组成的溶液；氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠的摩尔比为89.937-109.923:5-6.083:0.9-1.1:1.62-1.98:0.135-0.165:0.135-0.165:0.576-0.704。作为一种优选，氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠的摩尔比为101.278-108.455:5.547-6.083:0.1-1.1:1.72-1.88:0.145-0.165:0.145-0.165:0.612-0.704。本发明的目的之二在于提供一种上述的一步式胚胎培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在百级条件下配制，按上述比例依次将氯化钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、庆大霉素、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、d-山梨醇、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、(±)-α-硫辛酸、乙酰l-肉碱盐酸盐或乙酰l-肉碱和n-乙酰基-l-半胱氨酸加到水介质中，混合后得溶液i；2)在溶液i中冲co2保护气；3)在冲co2保护气的过程中加入上述分量的氨基酸和人血清白蛋白，混合后得溶液ii；4)将步骤3)配置好的溶液ii用0.2μm的滤膜过滤除菌后在co2培养箱中平衡5-10小时；5)将步骤4)平衡好的溶液ii在co2保护气无菌分装，得一步式胚胎培养液。进一步，步骤2)中冲的为体积百分数为6-7％的co2；步骤5)中co2保护气为体积百分数为6-7％的co2。在6-7％co2保护气作用下，无机盐缓冲成分不宜分解，有助于快速调节ph值，延长有效期。进一步，步骤4)中培养箱中平衡的条件为：37℃、6％的co2培养箱中平衡5-10小时，调节ph在7.20-7.40。作为一种优选，在步骤1)之前将配置器皿经过250℃，30min干热除热源。本发明的目的之三在于提供一种上述的一步式胚胎培养液在体外受精制剂中的应用。本发明的目的还在于提供一种利用上述的一步式胚胎培养液体外培养胚胎的方法，包括以下步骤：1)采用微滴法培养，在培养器皿中的液体微滴表面覆盖培养用油，在co2培养箱内平衡4～18小时；2)将胚胎置于已平衡的培养液中，于37℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养。本发明的有益效果在于：1)本发明提供的用于制备一步式胚胎培养液的组合物有清除体内氧自由基、螯合金属离子、再生体内其他抗氧化剂来发挥抗氧化作用，及保护线粒体功能、调节能量代谢，防止细胞毒素的积累和保护细胞的作用。2)本发明提供的一步式胚胎培养液保留了胚胎分泌入培养液中的有效成分，能起到保护细胞并抑制分解利用有害产物的作用，避免胚胎移植过程中可能受到的机械损伤和培养环境不同造成的应激反应而导致的囊胚形成率不高的问题。本发明的一步式胚胎培养液培养的囊胚形成率高，囊胚形成率≥94％。3)本发制备一步式胚胎培养液的方法操作简单，在制备过程中冲6-7％co2保护气，在6-7％co2保护气作用下，无机盐缓冲成分不宜分解，有助于快速调节ph值，延长有效期。具体实施方式以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1一步式胚胎培养液实施例2一步式胚胎培养液实施例3一步式胚胎培养液对比例1一步式胚胎培养液对比例2不加关键物料a、b、c，其他与实施例1相同物料百级条件氯化钠99.93mmol/l氯化钾5.53mmol/l硫酸镁1mmol/l葡萄糖1mmol/l庆大霉素50mg/l乙二胺四乙酸0.01mmol/l丙酮酸钠10.51mmol/l丙氨酰谷氨酰胺27.49mmol/l牛磺酸0.48mmol/ld-山梨醇0.23mmol/l氯化钙1.8mmol/l磷酸二氢钠0.15mmol/l磷酸二氢钾0.15mmol/l碳酸氢钠0.64mmol/l必需氨基酸0.7mmol/l-2.3mmol/l非必需氨基酸0.5mmol/l-1.5mmol/l人血清白蛋白0.5g/l对比例3只加关键物料a，其他与实施例1相同对比例4只加关键物料b，其他与实施例1相同对比例5只加关键物料c，其他与实施例1相同实施例4一步式胚胎培养液的制备方法实施例1～3和对比例1～5的一步式胚胎培养液按一下方法制备，包括以下步骤：1)将配置器皿经过250℃，30min干热除热源。2)在百级条件下配制，按上述各自比例依次物料准确称量添加到超纯水中，混合后得溶液i；3)在溶液i中冲6-7％co2保护气；4)在冲6-7％co2保护气的过程中加入上述分量的氨基酸和人血清白蛋白，混合后得溶液ii；5)将步骤3)配置好的溶液ii用0.2μm的滤膜过滤除菌后在放置37℃、6％的co2培养箱中平衡5-10小时，此步骤用来调节ph在7.20-7.40范围内；6)将步骤4)平衡好的溶液ii在6-7％co2保护气无菌分装，得一步式胚胎培养液。实施例5一步式胚胎培养液指标检测一、对本发明的一步式胚胎培养液进行检测取分装好的一步式培养液进行检测，检测项目是ph值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠胚试验来判断卵裂培养液是否合格。二、一步式培养液检测方法及结果(一)ph值检测取一定量成品用血气分析仪进行检测记录三次的值并取平均值为最终液体的ph值，在范围内为合格。(二)渗透压取25μl液体滴入0.5mlep管放入渗透压仪(冰点渗透压仪)探头等待检测值稳定，读出数值，同样方法检测三遍取平均值即为该液体的渗透压，在范围内为合格。(三)细胞毒性按gb/t16886.5的规定进行，细胞毒性计分应不超过1分。(四)皮内刺激按gb/t16886.10的规定进行，无皮内刺激反应。(五)致敏按gb/t16886.10的规定进行，应无致敏反应。(六)无菌检测采用中国药典的无菌检测的薄膜过滤法进行，过滤后的滤膜在细菌和真菌的培养基内培养应无菌生长为无菌合格。(七)热原按照中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅺd规定方法，体外受精液应无热原。(八)细菌内毒素检测采用中国药典内毒素的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行，判为定小于1eu/ml合格；(九)体外鼠胚试验1.超数排卵选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射pmsg10iu/只；48h后经腹腔注射hcg10iu/只，注射hcg当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜。2.准备培养皿培养胚胎前在细胞培养皿中制备一定数量30～50μl大小的液体微滴，表面覆盖培养用油，在co2培养箱内预平衡4～18小时。3.鼠胚采集合笼第二天早上检查交配情况，选择见栓小鼠备用。1-细胞胚胎收集：注射hcg后18至22小时后处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎。将收集到的絮状受精卵团放置到37℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移、清洗后，挑选出正常形态的受精胚胎，转移到供试品卵裂培养液微滴中，用于1-细胞鼠胚检测试验。4.体外培养采用微滴法培养，将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组，置于已平衡的培养液中，于37℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养；每组鼠胚数不少于50个。5.试验结果1-细胞胚胎体外分别培养96小时后记录囊胚数量。观察指标：囊胚形态观察。可接受准则：1)阳性对照组的囊胚形成率经统计学分析显著低于阴性对照组；2)阴性对照组的囊胚形成率≥80％。实施例6培养液培养受精卵囊胚形成实验利用实施例1～3和对比例1～5的培养液培养100个受精卵记录囊胚形成结果：1.实施例1配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：受精卵数囊胚形成数1009710098100962.实施例2配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：受精卵数囊胚形成数1009510094100963.实施例3配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：受精卵数囊胚形成数1009410095100944.对比例1配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：受精卵数囊胚形成数1007810076100785.对比例2不添加关键物料a、b、c配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：受精卵数囊胚形成数1006010063100616.对比例3只添加关键物料a，且添加量依次递增，见下表数据及结果：7.对比例4只添加关键物料b，且添加量依次递增，见下表数据及结果：8.对比例5只添加关键物料c，且添加量依次递增，见下表数据及结果：根据以上实验结果可见，本发明的培养液在培养过程中关键物料a,b,c之间是相辅相成，尤其是关键物料a的含量直接关系囊胚形成率，且每个物料在一定范围内呈线性相关，不含关键物料a,b,c的培养液囊胚形成率低，＜63％，可见关键物料a,b,c对囊胚形成都有明显的生理作用。含有关键物料a,b,c的培养液囊胚形成率高，囊胚形成率≥94％。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12