本发明涉及诱导细胞分化的方法及其专用培养基，特别是涉及一种诱导多能干细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。
背景技术：
由人多能干细胞(hpsc；包括胚胎干细胞hesc和诱导多能干细胞hipss)生成功能性肝细胞的能力将提供肝细胞源，以用于药物代谢研究和用于处理肝脏疾病的基于细胞的疗法。肝细胞是特别重要的，因为它们是负责药物代谢的细胞，并且因此用于身体的异型生物质的消除。鉴于这一作用和个体在他们的代谢特定药物的能力方面可能不同这一事实，从代表性的人群样本获得功能性肝细胞会对制药工业内的药物发现和测试具有巨大的影响。除了提供药物测试的新平台，hpsc源性肝细胞可以为肝病患者提供潜在的新疗法。虽然肝移植为终末期肝病提供了有效的处理，但是可行供体器官的短缺限制了可用此方法处理的患者群。肝细胞移植与用hpsc源性肝细胞开发的生物人工肝的设备代表了用于具有特定类型的肝病的患者的挽救生命的疗法。然而，这些应用依赖于由hpsc生成成熟代谢功能的细胞的能力。由于这样的事实：对控制肝细胞成熟的调节通路了解甚少，所以重现性和有效地生成这种细胞迄今为止具有挑战性。
鉴于功能性人肝细胞的潜在处理和商业上的重要性，已经针对优化由hpsc生成这些细胞作出了显著努力。几乎所有的方法都试图概括分化培养物中的肝发育的关键阶段，包括定形内胚层的诱导，内胚层至肝的命运的特定性，被称为肝细胞的肝祖细胞的生成和成肝细胞至成熟肝细胞的分化。在大多数研究中，以单层格式诱导分化，其中顺序加入已知的通路激动剂和拮抗剂以调节发育的早期阶段，包括内胚层的诱导和肝特化。通过这个策略，已经有可能优化这些早期分化的阶段和生成在定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞中高度富集的种群，定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞由诸如hex、甲胎蛋白和白蛋白的标记的表达所限定。虽然这些早期分化阶段合理地良好地建立，但是没有描述条件：例如促进肝细胞的成熟至功能性细胞，功能性细胞由阶段i和阶段ii药物代谢酶的活性所限定。用不同的方案生成的种群在它们的成熟状态上有很大的不同并且在大多数情况下表示未成熟肝细胞。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种简便易行的用于体外诱导多能干细胞向胆管细胞分化的专用培养基。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞的专用培养基，是在rpmi1640培养基的基础上添加了2.3％(v/v)胎牛血清，2.7％(v/v)b27，0.2mol/l缬氨酸，1％(v/v)青霉素。
本发明的第二个目的是提供一种体外诱导多能干细胞定向分化为胆管细胞的方法。
本发明所提供的体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞的方法，包括以下步骤：
1)将表皮形态发生蛋白(epimorphin，epm)基因导入进sw86细胞，得到高表达活性表皮形态发生蛋白的sw86细胞；
2)将高表达活性表皮形态发生蛋白的sw86细胞作为饲养层并进行生长阻滞处理后接种hpsc细胞，用上述体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞的专用培养基在37℃、5％co2下共培养，促使hpsc细胞向胆管细胞分化并形成管腔样结构，得到胆管细胞。
可按照常规方法将表皮形态发生蛋白基因转染sw86细胞，如通过含有表皮形态发生蛋白基因的重组真核表达载体或利用慢病毒载体系统或利用脂质体转染法等将表皮形态发生蛋白基因导入sw86细胞。
步骤2)中对高表达活性表皮形态发生蛋白的sw86细胞进行生长阻滞处理的方法为：将贴壁后的高表达活性表皮形态发生蛋白的sw86细胞用浓度为15-20μg/ml的丝裂霉素在37℃、5％co2下处理细胞1h。
用上述方法诱导得到的胆管细胞也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种诱导多能干细胞向胆管细胞分化的方法及其专用培养基。该方法是通过共培养的方式使得hpsc细胞分化为胆管细胞，采用的技术方案如下：通过脂质体转染法将epm基因导入sw86细胞中，再通过极限稀释法和流式单细胞接种法筛选稳定表达epm的sw86细胞并进行鉴定，然后将t7-epm-sw86细胞作为饲养层并进行生长阻滞处理后接种hpsc细胞，使hpsc在体外培养的条件下自主分化为胆管细胞并形成管腔样结构。形态学观察、基因水平的验证结果表明用本发明的方法及培养基可获得表达有胆管系相关标志yp、cx43、aquaporin-1等的胆管细胞。本发明提供了一条获得胆管细胞的新途径，应用前景广阔。
附图说明
图1为hpsc细胞与t7-epm-sw86细胞共培养时胆管标志物基因表达水平的检测
具体实施方式
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1、体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞
用本发明的方法体外诱导多能干细胞分化为胆管细胞，包括以下步骤：
一、稳定表达epm的sw86细胞单克隆的筛选
将携带epm基因的质粒t7-epm-pqxcin(构建方法见：hongbinz，elainefr，claudes，etal.theepimorphingeneishighlyconservedamonghumans，mice，andratsandmapstohumanchromosome7，mousechromosome5，andratchromosome12.genomics，1996，37：386-389.)经扩增、测序结果正确后，利用脂质体转染法将质粒导入sw86细胞(本实验室细胞库保存细胞系)中，具体步骤如下：
1)在37℃、5％co2条件下，培养sw86细胞至长满90-95％(细胞密度高时，可获得最佳结果)。转染前5小时更换完全培养基[hd-dmem(gibco公司)+10％胎牛血清(hyclone公司)+0.2mol/l缬氨酸(sigma公司)]。
2)用最优培养基opti-mem(gibco公司)稀释t7-epm-pqxcin质粒dna至浓度为200μg/ml。
3)用opti-mem稀释脂质体lipofectamine2000(invitrogen公司)至浓度为400μg/ml，室温孵育5分钟(脂质体lipofectamine2000必须在30分钟内与dna结合，否则活性降低)。
4)将稀释的t7-epm-pqxcin质粒dna与稀释的lipofectamine2000混合，室温孵育20分钟以形成dna-脂质体lipofectamine2000复合物(复合物室温稳定6小时；混合物可呈云雾状，但不妨碍转染)。
5)吸出培养液，用无血清培养液(gibco公司)洗细胞2次，每皿中加入无血清无抗生素培养液，再加入dna-脂质体lipofectamine2000复合物，在37℃、5％co2条件下培养5小时，更换完全培养基，继续培养，适时传代。
6)将转染细胞按10∶1传代后，培养24小时，换成含g418(终浓度400-600μg/ml)的hd-dmem培养液(gibco公司)进行筛选，每三天更换培养基一次，待对照组细胞全部死亡，其它孔板出现肉眼可见的细胞克隆时，开始挑取细胞克隆(备选方案：将转染细胞利用流式细胞仪接种单细胞)。
然后，提取转染细胞(以未转染的sw86为对照)的mrna和蛋白，分别进行rt-pcr检测，以β-actin为内参，经验证epm基因在基因和蛋白水平上均高度表达，说明epm基因已成功地转进sw86细胞中，得到高表达活性epm基因的sw86细胞，命名为t7-epm-sw86。
二、将hpsc细胞诱导分化为胆管细胞并形成管腔样结构
分化培养基：在rpmi1640培养基的基础上添加了3％(v/v，3-5％均可)胎牛血清(fetalcalfserum，fcs)，2％(v/v，1-3％均可)b27和1％(v/v，0.5-1.5％均可)青霉素。
1)常规培养epm-sw86细胞，0.25％胰酶消化，计数，以3×104个/孔接种于6孔板内培养；
2)待接种的epm-sw86细胞贴壁后，用浓度为15-20μg/ml的丝裂霉素处理细胞1h(37℃，5％co2，期间每隔15min摇匀细胞)以生长阻滞，1×pbs洗涤4-5次以除去残留丝裂霉素即可接种；
3)取正常培养的hpsc细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，1，200rpm离心5分钟，计数，以1.5-3×105个/孔接种于步骤2中的6孔板，每板4孔，其中2孔为阴性对照(未共培养的hpsc细胞)，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下共培养。
接种后12小时开始观察，之后每24小时观察一次。结果显示，与阴性对照相比，hpsc细胞与t7-epm-sw86(sep)细胞经过共培养后形成管腔样结构，结构内的细胞收缩且沿着管腔样结构方向拉伸。
三、共培养体系中hpsc细胞胆管分化的验证
取步骤二经共培养的hpsc细胞，提取mrna进行rt-pcr，引物为根据基因序列设计的常规引物。结果如图1所示，与阴性对照细胞相比，胆管标志yp、cx43、aquaporin-1等的表达量均上调，表明hpsc细胞经诱导分化成为胆管细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。