本发明涉及纳米自组装短肽(rada16-1、kld12)三维细胞培养技术在病毒培养中的应用。
背景技术：
在微生物引起的疾病中，病毒引起的疾病约占75％。病毒性疾病不仅传染性强、流行广，而且有效药物少。除急性感染外，有些病毒还可引起持续性感染，有些甚至与肿瘤和自身免疫病的发生密切相关。因此，一直以来对病毒的理化特性、致病机制、免疫机制及抗病毒药物的研究已经成为医学与生命科学研究的热点之一。病毒因缺少编码能量代谢或蛋白质合成所需元件(线粒体、核糖体)的遗传信息，只有在活细胞内方可显示其生命活性，因此比能在无生命培养基上生长的其他微生物培养困难。目前病毒培养方法有动物接种、鸡胚培养及细胞培养，其中细胞培养法为病毒分离鉴定、病毒研究中最常用的方法。
病毒体外研究多采用单层细胞培养法，培养装置常为玻璃或塑料的二维平面。事实上，这种培养方法是无法模拟具有空间结构的细胞外基质(extra-cellularmatrix，ecm)与细胞之间的相互作用，许多细胞从组织中分离并进行二维平面培养后，会逐渐平面化、异常分化并失去分化表型。数十年来人们逐渐认识到，细胞外微环境中各种细胞因子、神经递质、细胞之间及细胞与ecm相互粘附等多种信号积极参与了调节细胞的生长、分化、增殖及凋亡等生命活动。因此细胞培养技术经过不断的改进，经历了由二维到三维，由静止三维培养到动力三维培养的过程。细胞三维培养技术在组织工程、再生医学及肿瘤细胞体外研究中得到了广泛的应用。近年来有学者将动力三维细胞模型用于病毒的培养中取得成功，研究发现在三维细胞模型中的病毒感染效率较二维单层细胞培养模型高。但动力三维细胞培养较麻烦,条件不易控制,且材料较昂贵,不能用于大多数细胞和病毒的分离培养。自组装短肽形成的三维多孔纳米支架能够模仿天然ecm结构，为细胞生长提供支持，广泛应用于生物医学、组织工程学等研究领域。且这类自组装短肽水凝胶具有：(1)良好的生物相容性，无免疫原性，不携带任何危险的病原菌以及细胞毒性；(2)可调控生物降解速度；(3)易于设计或修饰；(4)形态结构的可控性；(5)能促进细胞粘附、生长和分化；(6)来源容易、制备简单等优点。目前未见将自组装短肽三维细胞培养技术应用于病毒分离培养的研究。我们前期的研究发现，rada16-1、kld12水凝胶中的293t细胞能被腺病毒感染，病毒感染后的细胞培养时间明显较二维培养时间长，且病毒感染后48-72h才能观察到病毒增殖，6-7d才能观察到细胞病变，这与临床病毒感染过程相似。
利用纳米自组装短肽(rada16-1、kld12)作为细胞三维培养支架体外培养细胞，这可以模拟细胞在体内生长的微环境，不仅可延长细胞体外培养时间，而且便于长时间体外观察病毒感染细胞情况。因此，建立纳米自组装短肽细胞三维培养病毒模型，有利于模拟体内微环境，在体外开展关于病毒持续性感染及病毒与肿瘤关系等方面的研究。与动力三维培养、旋转三维培养、微管三维培养、磁悬三维培养、组织三维培养相比，大大节约了成本，其操作简单易控，重复性好，能进行高通量的研究。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：解决目前病毒体外培养时间短、培养困难，尤其缺少体外病毒慢性感染模型的问题。本发明用纳米自组装短肽(rada16-1、kld12)三维细胞培养技术作为基础，体外培养病毒，能延长病毒在体外细胞内复制增殖的时间，三维培养能模拟体内微环境，与传统方法相比延长了培养时间、简化了操作流程、节约了成本。
本发明的技术方案是：一种基于纳米自组装短肽细胞三维培养支架培养病毒的方法，包含以下步骤：(1)三维培养易感细胞：二维复苏培养易感细胞，取生长状况良好单层培养细胞，用0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液，将收集的细胞用10％蔗糖洗涤，再用10％蔗糖制备成细胞悬液，在细胞培养板中加入相应完全培养液，肽溶液与细胞悬液充分混合后,加入培养液中使其集中在中央，5～10min待凝胶完全凝固后放入37℃co2培养箱中，30min后更换培养液一次；次日再更换细胞培养液一次，以后隔日换液；(2)目标病毒感染细胞三维模型的建立：上述步骤中制得的三维培养模型，接种目标病毒,细胞培养板中每孔接种目标病毒感染三维细胞，置37℃培养，24小时后吸出病毒液，用pbs清洗三次，并观察荧光，采用绿色荧光蛋白标记法观察病毒感染情况；并每天取样于-20℃反复冻融数次，取冻融后的上清液做real-timepcr检测上清及细胞中病毒量。
所述的易感细胞为相应目标病毒的易感细胞。
所述的目标病毒为目前能用二维细胞分离培养的病毒。
所述的肽溶液为rada16-1或kld12。
本发明的有益效果：(1)延长了病毒体外培养时间
传统的病毒分离培养法：鸡胚接种(用于少数病毒的分离)，组织培养(应用最多)分离培养病毒时间为2-5d，不利于病毒致病机制及增殖的研究，也不利于慢性病毒感染模型的建立及机制研究，本培养方法能在体外培养病毒25-45d，大大延长了培养时间，利于一些慢性感染病毒和潜伏感染病毒的研究。
(2)能模拟体内病毒感染微环境
纳米自组装短肽(rada16-1、kld12)可形成三维多孔纳米支架，其能模仿天然细胞外基质结构，为细胞生长提供支持，使细胞在立体空间内生长，这与体内细胞生长环境相似，有利于病毒感染的研究及模拟体内环境。
(3)本发明的病毒培养模型简化了病毒体外培养操作流程，节约了成本，并可以建立体外慢性病毒感染模型。
本发明的三维培养法较动力三维培养、旋转三维培养、微管三维培养、磁悬三维培养、组织三维培养相比，大大节约了成本，且操作简单易控，重复性好，能进行高通量的研究。三维培养时间长，病毒能在此模型中反复增殖感染，能模拟体内感染，并能建立慢性病毒感染模型，便于今后对慢性病毒感染及潜伏病毒感染的研究；也可用于病毒疫苗的研究及制备
附图说明
图1为透射电镜下rada16的结构；
图2为239t细胞在肽凝胶(rada16-1)三维模型内生长情况观察；a.钙黄绿素-am染色；b.dapi染色；c.pi染色；d.钙黄绿素-am+pi；e.钙黄绿素-am+dapi；f.钙黄绿素-am+dapi+pi；
图3为腺病毒感染肽凝胶(rada16-1)中三维培养239t细胞及cpe；
图4为透射电镜下kld12的结构；
图5为239t细胞在肽凝胶(kld12)三维模型内生长情况观察；a.钙黄绿素-am染色；b.dapi染色；c.pi染色；d.钙黄绿素-am+pi；e.钙黄绿素-am+dapi；f.钙黄绿素-am+dapi+pi；
图6为腺病毒感染肽凝胶(kld12)中三维培养239t细胞及cpe。
具体实施方式
实施例1：腺病毒的分离培养(rada16-1肽凝胶)
二维复苏培养293t细胞，取生长状况良好单层培养细胞，用0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液。将收集的细胞用10％蔗糖洗涤一次，再用10％蔗糖制备成细胞悬液，调整细胞浓度，在24孔细胞培养板中加入相应完全培养液300ul，肽溶液(75ul)与细胞悬液(75ul)按1:1充分混合,缓慢加入培养液中使其集中在中央，(肽的终浓度为5mg/ml，每孔种入3.5-5万个细胞)5～10min待凝胶完全凝固后放入37℃co2培养箱中，30min后更换培养液一次。次日再更换细胞培养液一次。用pbs清洗三维培养293t细胞三次，接种腺病毒,每孔接种4x106拷贝腺病毒感染，置于37℃培养，24小时后吸出病毒液，用pbs清洗三次，加入完全培养液,并开始观察荧光，采用绿色荧光蛋白标记法观察病毒感染情况；并每天取样于-20℃反复冻融数次，取冻融后的上清液做real-timepcr检测上清及细胞中病毒量。
a.绿色荧光蛋白标记法观察24孔板三维培养293t细胞,接种后次日感染腺病毒,以后逐日观察荧光细胞,每孔观察三个视野记录荧光细胞数量。病毒感染后60-72h能看见荧光细胞，以后逐渐增多，感染后7-8d达高峰，这时细胞开始出现cpe(细胞团出现小洞或细胞团开始溶解，能见单个细胞)以后逐渐减弱。见图1。
b.real-timepcr检测上清及细胞中病毒量：96孔板三维培养293t细胞,接种后次日感染腺病毒，分别在感染后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22d收集细胞及上清保存于-20℃，用real-timepcr检测上清及细胞中病毒量，pcr结果显示腺病毒量在逐日增加，8-15d最高，待33d仍能检测到腺病毒核酸。
实施例2：h1n1流感病毒的分离培养(rada16-1肽凝胶)
二维复苏培养mdck细胞，取生长状况良好单层培养细胞，用0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液。将收集的细胞用10％蔗糖洗涤一次，再用10％蔗糖制备成细胞悬液，调整细胞浓度，在24孔细胞培养板中加入相应完全培养液300ul，肽溶液(75ul)与细胞悬液(75ul)按1:1充分混合,缓慢加入培养液中使其集中在中央，(肽的终浓度为5mg/ml，每孔种入3.5-5万个细胞)5～10min待凝胶完全凝固后放入37℃co2培养箱中，30min后更换培养液一次。次日再更换细胞培养液一次。用pbs清洗三维培养mdck细胞三次，接种h1n1流感病毒,每孔接种100tcid50流感病毒感染，置于37℃培养，24小时后吸出病毒液，用pbs清洗三次，加入完全培养液，逐日观察cpe；每天取上清做血凝试验,观察病毒增殖情况；并取水凝胶及细胞于-20℃反复冻融数次，取冻融后的上清液做rt-pcr检测上清中病毒量。
a.病毒感染后60-72h能在上清中测出血凝效价，以后逐渐增高，感染后7-8d达高峰，这时细胞开始出现cpe(细胞团出现小洞或细胞团开始溶解，能见单个细胞),持续5-8d后血凝效价开始逐渐降低。
b.rt-pcr检测细胞中病毒量：96孔板三维培养mdck细胞,接种后次日感染腺病毒,分别在感染后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22d收集细胞及上清保存于-20℃，用rt-pcr检测上清及细胞中病毒量，pcr结果显示流感病毒量在逐日增加，8-20d最高，待33d仍能检测到流感病毒核酸。
实施例3：呼吸道合胞病毒(rsv)的分离培养(rada16-1肽凝胶)
二维复苏培养jec细胞，取生长状况良好单层培养细胞，用0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液。将收集的细胞用10％蔗糖洗涤一次，再用10％蔗糖制备成细胞悬液，调整细胞浓度，在24孔细胞培养板中加入相应完全培养液300ul，肽溶液(75ul)与细胞悬液(75ul)按1:1充分混合,缓慢加入培养液中使其集中在中央，(肽的终浓度为5mg/ml，每孔种入3.5-5万个细胞)5～10min待凝胶完全凝固后放入37℃co2培养箱中，30min后更换培养液一次。次日再更换细胞培养液一次。用pbs清洗三维培养jec细胞三次，接种rsv,每孔接种100tcid50rsv，置于37℃培养，24小时后吸出病毒液，用pbs清洗三次，加入完全培养液,逐日观察cpe；在感染后3、6、9、12、15、18、21、24d用间接免疫荧光法检测rsv。
a.感染后第7d细胞开始出现cpe(细胞团出现小洞或细胞团开始溶解，能见单个细胞)，感染15d后能见很多细胞碎片，大细胞团溶解，细胞团基本不再生长。
b.间接免疫荧光法检测rsv，分别在rsv感染3、6、9、12、15、18、21、24d，弃去孔内培养液，pbs反复冲洗24孔培养板三次，然后用冷丙酮固定10分钟，2％trition-100打孔5分钟，pbs液冲洗三次，3min/次，每孔加入1:2rsv抗体50ul，湿盒37℃孵育45分钟，pbs液冲洗三次，3min/次，每孔加入1:30羊抗鼠iggfitc二抗100ul，湿盒37℃孵育45分钟，pbs液冲洗三次，3min/次，倒置荧光显微镜观察。第6d开始可见胞内及包膜绿色荧光，12、15d胞内及包膜绿色荧光最强，以后缓慢减弱，说明rsv能在此三维培养模型中进行分离培养。
实施例4：腺病毒的分离培养(kld12肽凝胶)
二维复苏培养293t细胞，取生长状况良好单层培养细胞，用0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液。将收集的细胞用10％蔗糖洗涤一次，再用10％蔗糖制备成细胞悬液，调整细胞浓度(6.67x105个/ml可以删掉)，在24孔细胞培养板中加入相应完全培养液300ul，肽溶液(75ul)与细胞悬液(75ul)按1:1充分混合,缓慢加入培养液中使其集中在中央，(肽的终浓度为5mg/ml，每孔种入3.5-5万个细胞)5～10min待凝胶完全凝固后放入37℃co2培养箱中，30min后更换培养液一次。次日再更换细胞培养液一次。用pbs清洗三维培养293t细胞三次，接种腺病毒,每孔接种4x106拷贝腺病毒感染，置于37℃培养，24小时后吸出病毒液，用pbs清洗三次，加入完全培养液,并开始观察荧光，采用绿色荧光蛋白标记法观察病毒感染情况；并每天取样于-20℃反复冻融数次，取冻融后的上清液做real-timepcr检测上清及细胞中病毒量。
a.绿色荧光蛋白标记法观察24孔板三维培养293t细胞,接种后次日感染腺病毒,以后逐日观察荧光细胞,每孔观察三个视野记录荧光细胞数量。病毒感染后60-72h能看见荧光细胞，以后逐渐增多，感染后7-8d达高峰，这时细胞开始出现cpe(细胞团出现小洞或细胞团开始溶解，能见单个细胞)以后逐渐减弱。见图1。
b.real-timepcr检测上清及细胞中病毒量：96孔板三维培养293t细胞,接种后次日感染腺病毒，分别在感染后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22d收集细胞及上清保存于-20℃，用real-timepcr检测上清及细胞中病毒量，pcr结果显示腺病毒量在逐日增加，8-15d最高，待33d仍能检测到腺病毒核酸。
实施例5：h1n1流感病毒的分离培养(kld12肽凝胶)
二维复苏培养mdck细胞，取生长状况良好单层培养细胞，用0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液。将收集的细胞用10％蔗糖洗涤一次，再用10％蔗糖制备成细胞悬液，调整细胞浓度(6.67x105个/ml可以删掉)，在24孔细胞培养板中加入相应完全培养液300ul，肽溶液(75ul)与细胞悬液(75ul)按1:1充分混合,缓慢加入培养液中使其集中在中央，(肽的终浓度为5mg/ml，每孔种入3.5-5万个细胞)5～10min待凝胶完全凝固后放入37℃co2培养箱中，30min后更换培养液一次。次日再更换细胞培养液一次。用pbs清洗三维培养mdck细胞三次，接种h1n1流感病毒,每孔接种100tcid50流感病毒感染，置于37℃培养，24小时后吸出病毒液，用pbs清洗三次，加入完全培养液，逐日观察cpe；每天取上清做血凝试验,观察病毒增殖情况；并取水凝胶及细胞于-20℃反复冻融数次，取冻融后的上清液做rt-pcr检测上清中病毒量。
a.病毒感染后60-72h能在上清中测出血凝效价，以后逐渐增高，感染后7-8d达高峰，这时细胞开始出现cpe(细胞团出现小洞或细胞团开始溶解，能见单个细胞),持续5-8d后血凝效价开始逐渐降低。
b.rt-pcr检测细胞中病毒量：96孔板三维培养mdck细胞,接种后次日感染腺病毒,分别在感染后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22d收集细胞及上清保存于-20℃，用rt-pcr检测上清及细胞中病毒量，pcr结果显示流感病毒量在逐日增加，8-20d最高，待33d仍能检测到流感病毒核酸。
实施例6：呼吸道合胞病毒(rsv)的分离培养(kld12肽凝胶)
二维复苏培养jec细胞，取生长状况良好单层培养细胞，用0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液。将收集的细胞用10％蔗糖洗涤一次，再用10％蔗糖制备成细胞悬液，调整细胞浓度(6.67x105个/ml可以删掉)，在24孔细胞培养板中加入相应完全培养液300ul，肽溶液(75ul)与细胞悬液(75ul)按1:1充分混合,缓慢加入培养液中使其集中在中央，(肽的终浓度为5mg/ml，每孔种入3.5-5万个细胞)5～10min待凝胶完全凝固后放入37℃co2培养箱中，30min后更换培养液一次。次日再更换细胞培养液一次。用pbs清洗三维培养jec细胞三次，接种rsv,每孔接种100tcid50rsv，置于37℃培养，24小时后吸出病毒液，用pbs清洗三次，加入完全培养液,逐日观察cpe；在感染后3、6、9、12、15、18、21、24d用间接免疫荧光法检测rsv。
a.感染后第7d细胞开始出现cpe(细胞团出现小洞或细胞团开始溶解，能见单个细胞)，感染15d后能见很多细胞碎片，大细胞团溶解，细胞团基本不再生长。
b.间接免疫荧光法检测rsv，分别在rsv感染3、6、9、12、15、18、21、24d，弃去孔内培养液，pbs反复冲洗24孔培养板三次，然后用冷丙酮固定10分钟，2％trition-100打孔5分钟，pbs液冲洗三次，3min/次，每孔加入1:2rsv抗体50ul，湿盒37℃孵育45分钟，pbs液冲洗三次，3min/次，每孔加入1:30羊抗鼠iggfitc二抗100ul，湿盒37℃孵育45分钟，pbs液冲洗三次，3min/次，倒置荧光显微镜观察。第6d开始可见胞内及包膜绿色荧光，12、15d胞内及包膜绿色荧光最强，以后缓慢减弱，说明rsv能在此三维培养模型中进行分离培养。