本发明涉及的是一种三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物及其制备方法与作为可逆、选择性的丁酰胆碱酯酶抑制剂的用途，属于新化合物的提出、制备与应用技术领域。
背景技术：
阿尔兹海默症(alzheimer'sdisease，ad)是由德国神经病理学家aloisalzheimer于1907年发现并命名，是一种不可逆的、渐进行的中枢神经系统退行性疾病，表现为认知损伤和渐进性记忆障碍。ad的临床表现以健忘、失眠、失语、失忆、神情呆滞、肢体麻木、迷路等智能损害为主，俗称老年痴呆症。2016年世界阿尔兹海默症(worldalzheimerreport)报告显示，目前全球ad患者总数达到4700万，预计到2050年该数字将超过1.31亿(m.prince,a.comas-herrera等alzheimer'sdiseaseinternational,2016)。对于ad的发病机理有一些相互较为独立的假说，例如aβ假说、过度磷酸化tau蛋白假说、胆碱能假说、氧化应激等，各种假说之间相互关联。其中最有效的治疗策略是胆碱能障碍假说，胆碱能功能障碍直接导致认知衰退(r.t.bartus,exp.neurol.163(2000)495-529)，目前临床治疗ad的首选药物仍然是针对恢复胆碱能系统功能的。aβ淀粉样蛋白斑是由胆碱酯酶(che)导致的，包括乙酰胆碱酯酶(ache)和丁酰胆碱酯酶(buche)，胆碱酯酶抑制剂能减小这种蛋白斑(l.yu,r.cao等,bioorg.med.chem.lett.20(2010)3254-3258)。而且，胆碱能系统异常还与其它的神经退行性疾病密切相关，如帕金森综合征(pd)、路易氏体失智症、血管性痴呆等(e.perry,m.walker等,trendsneurosci.22(1999)273-280.m.m.mesulam,neuroscience110(2002)627-639)。因此，服用胆碱酯酶抑制剂是提高大脑内乙酰胆碱水平的有效方法，胆碱酯酶能被ache和buche水解，但是buche比ache表现出更少的底物特异性(s.f.mchardy,h.l.wang等,expert.opin.ther.pat.27(2017)455-476)。野生型小鼠用选择性ache抑制剂处理，胆碱酯酶浓度增加了16倍，而用选择性buche抑制剂则没有增加(x.norel,m.angrisani等,br.j.pharmacol.108(1993)914-919)。ache在健康脑的乙酰胆碱水解中起主要作用，而buche在ache缺陷脑中主导乙酰胆碱的水解。在ache缺陷小鼠中，活性buche减小了海马乙酰胆碱的过高水平(f.h.darras,b.kling等,bioorg,med,chem.22(2014)5020-5034)。为了避免ache抑制引起的不良反应，开发有效的、选择性的buche抑制剂来提高进展期ad中的乙酰胆碱水平具有潜在的优势。
buche是一个潜在治疗靶点，它能恢复进展期ad患者大脑的乙酰胆碱水平、改善认知功能障碍、减少不良反应。虽然有不同结构类型的buche抑制剂，但是选择性buche抑制剂的结构类型还很少(d.palanimuthu,r.poon等,eur.j.med.chem.139(2017)612-632)。作为多因素神经退行性疾病，ad治疗的另一个趋势是多靶点配体，其中大多数胆碱酯酶抑制伴随着影响其它生物学特性，如影响单胺氧化酶(mao)代谢、线粒体功能和抗氧化作用等。而且，同时抑制mao和胆碱酯酶活性促使人们寻找具有潜在改变疾病治疗的新型治疗药物(m.naoi,w.maruyama等,curr.top.med.chem.12(2012)2177-2188.h.sugimoto,y.limura等,j.med.chem.38(1995)4821–4829)。基于上述分析，人类期望发现越来越多的具有不同结构类型的潜在胆碱酯酶抑制剂。因此，发现具有高选择性buche抑制剂具有理论价值和现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物、及其制备方法与用途；本发明的另一个目的是提供一种可逆、选择性的buche抑制剂，并将其应用于治疗和预防阿尔茨海默氏病有关的疾病的药物或药物组合物中。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物，其结构如下列通式ⅰ所示：
ⅰ：
其中r1为卤素、c1-c6-烷基或c1-c6-烷氧基；r2为卤素、c1-c6-烷基或c1-c6-烷氧基；r3为卤素、c1-c6-烷基或c1-c6-烷氧基；r4为卤素、c1-c6-烷基或c1-c6-烷氧基。
作为上述技术方案的改进，所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物，所述的r1为卤素、甲基、乙基或甲氧基。
作为上述技术方案的改进，所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物，所述的r2为卤素、甲基、乙基或甲氧基。
作为上述技术方案的改进，所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物，所述的r3为卤素、甲基、乙基或甲氧基。
作为上述技术方案的改进，所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物，所述的r4为卤素、甲基、乙基或甲氧基。
作为上述技术方案的改进，一种三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、化合物ⅰ和化合物ⅱ按照摩尔比1︰0.5～2投料反应制得化合物ⅲ：
ⅰ：
反应溶剂为醇类、胺类或酸类质子溶剂；反应催化剂为哌啶或10％～60％的碱水溶液；反应温度为0℃～100℃；
步骤二、化合物ⅲ和水合肼按照质量比1︰2～5投料反应制得化合物ⅳ：
ⅳ：
反应溶剂为极性偶极溶剂；反应温度为20℃～100℃；
步骤三、化合物ⅳ和化合物ⅴ按照摩尔比1︰0.5～2投料反应制得所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物：
ⅴ：
反应物为n,n'-羰基二咪唑(cdi)、光气或三光气；
反应溶剂为非质子溶剂；反应温度为-20℃～60℃。
作为上述技术方案的改进，所述的制备方法，
在所述步骤一中，反应溶剂为乙醇、水或乙酸；反应催化剂为20％～40％的氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液；反应温度为50℃～70℃；
在所述步骤二中，反应溶剂为乙醇、乙腈、水或dmf；反应温度为60℃～80℃；
在所述步骤三中，反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或丙酮；反应温度为0℃～30℃。
作为上述技术方案的改进，所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将化合物ⅰ和化合物ⅱ加入到反应溶剂中配成溶液或混悬液，冰水浴搅拌，滴加20％～40％的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，控制温度不超过20℃；缓慢升温至60℃，在60℃条件下搅拌4～10小时；点板检测，待化合物ⅰ反应完全后，停止反应，将反应液倒入冰中，搅拌，用hcl调节ph值至2～3，静置12～24小时，抽滤，滤饼依次用水洗两次、石油醚洗两次，在60℃条件下减压干燥，得化合物ⅲ；
步骤二、将化合物ⅲ加到反应溶剂中，搅拌，加热到60℃，在60℃条件下滴加2～5倍当量的水合肼，继续搅拌反应3～6小时；点板检测，待化合物ⅲ反应完全后，停止反应，将反应液倒入冰中，静置2～6小时，抽滤，滤饼用70％～95％乙醇重结晶，抽滤，滤饼用含水乙醇洗涤，在60℃条件下减压干燥，得化合物ⅳ；
步骤三、将化合物ⅳ和化合物ⅴ溶解在反应溶剂中，水浴冷却，在20～30℃条件下反应2～4小时；点板检测，待化合物ⅳ反应完全后，停止反应，将反应液依次用水、食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至少量，用乙醇重结晶，得到的产物干燥后，即得所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物。
作为上述技术方案的改进，所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物在制备丁酰胆碱酯酶抑制剂类药物或药物组合物中的应用。
作为上述技术方案的改进，所述的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物在制备治疗和预防阿尔茨海默氏病有关的疾病的药物或药物组合物中的应用。
本发明还公开了三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物在制备buche抑制剂类药物或药物组合物中的应用；具体地，是在制备治疗和预防阿尔茨海默氏病有关的疾病的药物或药物组合物中的应用。
本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：
本发明所提供的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物是一种可逆、选择性的buche抑制剂，具有良好的胆碱酯酶抑制活性，且对buche抑制活性具有选择性；其中部分优选的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物具有较好的buche抑制活性，部分三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物的buche抑制活性优于阳性对照药donepezil。
附图说明
图1为三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物的合成路线图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明具体实施方式中涉及的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物如表1所示：
表1三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物的不同基团
实施例1～实施例9
衍生物1～衍生物9的制备(合成路线如图1所示)
将丙酮(10mmol)、取代的水杨醛(11mmol)和乙醇(10ml)加到反应瓶中，冰水浴搅拌30min，滴加40％的naoh水溶液(2ml)，反应液逐渐由无色变为红色，并有固体析出。缓慢升温至60℃，在60℃条件下搅拌4～10h，点板检测，待苯乙酮反应完全后，停止反应。将反应液倾倒入冰水中，用2mol/lhcl调节ph值至2～3，静置12～24h，抽滤，用滤饼依次用水、石油醚洗涤，在60℃条件下减压干燥，得查尔酮；
将所得到的查尔酮加到乙醇(20ml)中，搅拌，加热到60℃，在60℃条件下滴加5倍当量的水合肼，继续搅拌反应3～6h，点板检测，待查尔酮反应完全后，停止反应，将反应液倒入碎冰中，静置2～6h，抽滤，滤饼用70％～95％乙醇重结晶，抽滤，滤饼用含水乙醇洗涤，在60℃条件下减压干燥，得吡唑啉；
将所得到的吡唑啉(5.0mmol)、羰基二咪唑(三光气或光气)(6.0mmol)溶解在ch2cl2(20ml)中(必要时可稍微加热)，水浴冷却在20～30℃条件下反应2～4h。点板检测，待吡唑啉反应完全后，停止反应，将反应液依次用水、食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至少量，用少量乙醇重结晶(如产物不纯，可通过快速硅胶柱色谱纯化)，得到的产物干燥后，即得到衍生物1～衍生物9。
所述三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物1～衍生物9的波谱分析如下所示：
实施例1
衍生物1：浅黄色粉末，产量为42％；m.p.162-164℃；1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.37–7.32(m,1har-h),7.19(td,j＝7.4,3.0hz,1har-h),7.16–7.12(m,2har-h),5.30–5.22(m,1h10b-h),3.35(dd,j＝16.7,10.2hz,1h1-ha),3.11(dd,j＝16.1,12.5hz,1h1-hb),2.19(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc11h11n2o2:203.0815；found:203.0817.
实施例2
衍生物2：白色粉末，产量为40％；m.p.237-240℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.42(d,j＝2.2hz,1har-h),7.03(d,j＝1.2hz,1har-h),5.31–5.20(m,1h10b-h),3.35(dd,j＝16.8,10.3hz,1h1-ha),3.11(dd,j＝16.7,12.7hz,1h1-hb),2.20(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc11h9cl2n2o2:271.0036；found:271.0038.
实施例3
衍生物3：白色粉末，产量为40％；m.p.229-232℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.81–7.67(m,1har-h),7.21(dd,j＝2.1,1.1hz,1har-h),5.26(dd,j＝12.5,10.4hz,1h10b-h),3.35(dd,j＝16.9,10.3hz,1h1-ha),3.12(dd,j＝16.8,12.6hz,1h1-hb),2.20(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc11h9br2n2o2:358.9025；found:358.9023.
实施例4
衍生物4：白色粉末，产量为40％；m.p.184-186℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.31(dd,j＝8.7,2.4hz,1har-h),7.12(dd,j＝2.4,1.0hz,1har-h),7.09(d,j＝8.8hz,1har-h),5.24(dd,j＝12.6,10.4hz,1h10b-h),3.34(dd,j＝16.8,10.3hz,1h1-ha),3.11(dd,j＝17.9,12.7hz,1h1-hb),2.19(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc11h10cln2o2:237.0425；found:237.0430.
实施例5
衍生物5：白色粉末，产量为35％；m.p.211-213℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.46(dd,j＝8.7,1.7hz,1har-h),7.27–7.25(m,1har-h),7.04(d,j＝8.7hz,1har-h),5.24(dd,j＝12.6,10.4hz,1h10b-h),3.33(dd,j＝16.8,10.3hz,1h1-ha),3.11(dd,j＝17.9,12.7hz,1h1-hb),2.18(d,j＝6.2hz,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc11h10brn2o2:280.9920；found:280.9925.
实施例6
衍生物6：白色粉末，产量为40％；m.p.218-221℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.60–7.51(m,1har-h),7.06(dd,j＝8.6,5.3hz,2har-h),5.34–5.21(m,1h10b-h),3.37(dd,j＝16.8,10.3hz,1h1-ha),3.11(dd,j＝16.7,12.8hz,1h1-hb),2.19(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc11h10brn2o2:280.9920；found:280.9918.
实施例7
衍生物7：白色粉末，36％；m.p.228-231℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.59(d,j＝2.2hz,1har-h),7.07(s,1har-h),5.31–5.20(m,1h10b-h),3.34(dd,j＝16.8,10.3hz,1h1-ha),3.11(dd,j＝16.3,12.8hz,1h1-hb),2.20(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc11h9brcln2o2:314.9530；found:314.9537.
实施例8
衍生物8：白色粉末，产量为35％；m.p.189-192℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.12(t,j＝8.0hz,1har-h),6.92(d,j＝8.2hz,1har-h),6.69(d,j＝7.7hz,1har-h),5.25(dd,j＝12.5,10.5hz,1h10b-h),3.89(s,3hch3),3.32(dd,j＝16.8,10.3hz,1h1-ha),3.10(dd,j＝16.3,13.3hz,1h1-hb),2.18(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc12h13n2o3:233.0921；found:233.0925.
实施例9
衍生物9：白色粉末，产量为40％；m.p.174-177℃；1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.12(d,j＝8.3hz,1har-h),7.01(d,j＝8.3hz,1har-h),6.91(s,1har-h),5.29–5.15(m,1h10b-h),3.32(dd,j＝16.8,10.2hz,1h1-ha),3.09(dd,j＝16.3,13.3hz,1h1-hb),2.34(s,3hch3),2.18(s,3hch3)；tof-hrms:m/z[m+h]+calcdforc12h13n2o2:217.0972；found:217.0981.
试验例1
三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物1～9的che生物活性检测：
采用ellman法检测化合物对酶促eeache(c3389-500un；sigma)和eqbuche(c4290-1ku；sigma)活性的影响。ache(buche)能水解硫代乙酰胆碱(硫代丁酰胆碱)，产生的硫代胆碱，它能与5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)反应，生成的黄色5-硫-2-硝基苯甲酸可在410nm处产生紫外吸收，通用反应式为acetylthiocholine+h2o+ache→acetylrate+thiocholine，thiocholine+dtnb→5-thio-2-nitrobenzoicacid，化学反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。当化合物对胆碱酯酶的有抑制作用时，则单位时间内生成的黄色5-硫-2-硝基苯甲酸量会减少，颜色越浅，表明抑制能力越强。
在48孔板中进行实验，终体积为500μl。每孔含有0.036u/ml的eeache或eqbuche和0.1m的ph8磷酸盐缓冲液。它们在37℃下以不同化合物浓度预温育20分钟。然后加入0.35mm乙酰硫代胆碱碘化物(atch；a5751-1g；sigma)或0.5mm丁酰硫代胆碱碘化物(20820-1g；sigma)和0.35mm5,5'-二硫双-2-硝基苯甲酸(dtnb；d8130-1g；sigma)。dtnb产生黄色阴离子5-硫代-2-硝基苯甲酸以及乙酰硫代胆碱或丁酰硫代胆碱的酶促降解。在bioteksynergyhtx多模读取器中在20分钟后在410nm下测量吸光度的变化。从抑制曲线(对数抑制剂浓度和抑制百分比)图解确定ic50值。对照实验在相同条件下进行，不含抑制剂，空白液含有缓冲液，dmso，dtnb和底物。
本发明所述三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物1～9的che生物活性检测的结果如表2所示。
表2.化合物衍生物1～9抑制chea的ic50值。
a每个ic50值从三实验平均±sem(n＝3)；
bache取自于电鳗；
cbuche取自于马血清；
d对ache或buche在浓度为10μm没有抑制活性。
本发明的试验例1的结果表明：
(1)本发明提供的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮的衍生物具有良好的che抑制活性；
(2)三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物对buche抑制活性具有选择性；
(3)本发明涉及的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物1～7具有较好的buche抑制活性，且衍生物2～7的buche抑制活性优于阳性对照药donepezil。
应用例1
以常规方式制备下列组成的制剂：
将实施例1～9中制备的三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物过120目筛，可压性淀粉过100目筛；称取处方量的可压性淀粉与原料按等量递增法混匀；羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮溶解在75％乙醇中配成溶液，取上述混粉，用羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液作润湿剂制软材，30目筛制粒，60℃干燥2～3小时，26目筛整粒；
取以上颗粒，加入处方量的硬脂酸镁，混匀，测定中间体含量，压片或灌装于胶囊，即可。
三环吡唑[1,5-c][1,3]苯并噁嗪酮衍生物还可以制成缓释片、滴丸、冲剂、注射剂等。其临床推荐剂量：30～100mg/天，口服，一日两次。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。