一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基及制备方法与流程

文档序号:15457409发布日期:2018-09-15 01:29
本发明涉及培养基
技术领域
,具体为一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基及制备方法。
背景技术
:间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等多种组织中,可通过分离采集,在体外大量扩增培养1研究证明,间充质干细胞作为一类多能干细胞,具有很好的自我更新及多向分化潜能,经特定条件诱导,可分化成为脂肪细、骨、软骨、肌、肝脏、神经、皮肤等多种类型组织细胞,基于此特性,间充质干细胞已被尝试应用于多种组织及器官功能损伤修复研究中,其中,基于间充质干细胞定向成软骨分化特性的软骨组织再造修复研究,已在动物及临床前期的研究中取得令人满意的疗效,具有极大的临床转化潜能,应用市场巨大。软骨组织的特殊结构(无血管分布),决定了其在损伤后难以自我修复的特性,间充质干细胞作为种子细胞,经特定条件诱导,可向软骨细胞定向分化,通过将由间充质干细胞分化而来的软骨组织进行移植,可满足临床软骨损伤修复及特定整形操作需求,疗效显著,但在现有条件下,人间充质干细胞成软骨分化效率有限,因此,为获得足量的间充质干细胞来源的软骨细胞进行临床应用,需通优化特定培养条件,进行定向分化诱导,从而在短期内高效获得充足且均一的软骨组织细胞进行损伤修复,现有人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基成分一般为:DMEM培养基,10%胎牛血清(FBS),1mM丙酮酸钠,20ug/mL脯氨酸,1XITS,50μg/mL抗坏血酸,100nM地塞米松,以及10ng/mLTGF-β。公开号为CN105695402A的中国发明专利,公开了一种间充质干细胞成软骨诱导诱导分化组合物及使用方法,该培养基在高糖DMEM培养基基础上,添加10%胎牛血清、50ug/mLL-抗坏血酸-2-2磷酸酯,5ng/mLTGFb2,100nM地塞米松,25ug/mL维生素C,20ug/mL脯氨酸,2.5ug/mL吲哚美辛,1XITS+1premix,1ug/ml氯地孕酮酯,经14-21天诱导培养后进行软骨细胞染色鉴定,该培养基只针对脐带来源间充质干细胞进行成软骨诱导分化,诱导分化效率不理想,特异性较低,出现成骨分化迹象,且其所含氯地孕酮成分不易获得,成本较高,缺乏实际应用价值。综上所述,现有的成软骨诱导分化培养基无法高效稳定诱导人多种组织来源间充质干细胞向成软骨细胞分化,仍需更为优化的分化条件提高人间充质干细胞成软骨诱导分化效率,从而为间充质干细胞成软骨分化能力鉴定及临床软骨损伤治疗及美容提供有利条件。技术实现要素:为解决现有技术中存在的成软骨诱导效率及特异性不够理想、诱导时间较长等问题,本发明提供一种能高效稳定诱导多种人组织来源间充质干细胞定向成软骨分化的培养基及其制备方法。一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基,其特征在于:有以下组分制成,α-MEM/HG-DMEM培养基、胎牛血清5-50%体积百分比、丙酮酸钠50-200mg/ml浓度、抗坏血酸20-200μg/ml浓度、脯氨酸10-100μg/ml浓度、塞米松50-500nM体积、ITS0.5-20%体积百分比、TGF-β0.1-20ng/ml浓度、胰岛素生长因子-20.5-50nM体积。优选由以下组分制成,α-MEM/HG-DMEM培养基、胎牛血清5-50%体积百分比、丙酮酸钠50-200mg/ml浓度、抗坏血酸20-100μg/ml浓度、脯氨酸10-500μg/ml浓度、塞米松50-200nM体积、ITS0.5-5%体积百分比、TGF-β0.1-10ng/ml浓度、胰岛素生长因子-20.5-50nM体积。优选由以下组分制成,HG-DMEM培养基、胎牛血清10%体积百分比、丙酮酸钠100mg/ml浓度、抗坏血酸50μg/ml浓度、脯氨酸20μg/ml浓度、塞米松100nM体积、ITS1%体积百分比、TGF-β5ng/ml浓度、胰岛素生长因子-220nM体积。本发明提供的人间充质干细胞成软骨高效诱导分化培养基及使用方案是在现有成软骨分化培养基中加入胰岛素生长因子-2。现有成软骨诱导分化培养基中的地塞米松可通过活化WNT/β-catenin信号通路上调人间充质干细胞的聚集蛋白聚糖;抗坏血酸可通过活化ERK信号,从而激活Runx2、Sox9等成软骨基因转录,促进二型胶原表达。TGF-β3可通过活化Smad2/3/4信号,激活成软骨相关基因转录,促进间充质干细胞成软骨分化6。脯氨酸可通过形成脯氨酸环促进间充质干细胞诱导产生的α胶原螺旋结构稳定维持。含有胰岛素、转铁蛋白,和硒的ITS同样可通过上调Sox9基因转录表达,从而促进二型胶原的表达。本发明在现有成软骨诱导分化培养基成分中添加胰岛素生长因子-2。我们在研究中发现,胰岛素生长因子-2可进一步上调间充质干细胞中Sox9及BMP2的mRNA转录,促进二型胶原表达沉积,正向调控聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白和粘多糖表达,从而进一步高效促进人间充质干细胞向软骨细胞特异性分化。一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基的制备方法,包括以下步骤,(1)、培养皿消毒,将培养皿用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净,晾干后用纸或布包好,或装在金属盒内,放置在高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭菌温度应为121℃,灭菌时间应为3min,灭菌后烘干备用;(2)、添加源培养基,将HG-DMEM培养基添加到培养皿中,添加过程应佩戴无菌手套;(3)、成分混合,按所述浓度加入FBS、丙酮酸钠母液、抗坏血酸母液、脯氨酸母液、地塞米松母液、ITS母液、TGF-β3母液和胰岛素生长因子-2母液,混合均匀;(4)、过滤除菌,将混合后的培养液使用0.22μm滤膜过滤除菌。所述人间充质干细胞成软骨诱导分化通过以下方法,1)获得干细胞:利用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养扩增人间充质干细胞;2)预处理:使用胰酶消化细胞,用所述人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基重悬细胞,浓度为2X107个/mL;3)分组培养:将10μL细胞悬液滴加到六孔板上,每孔5滴;4)分化培养:将细胞在培养箱中放置2小时,每孔加入所述人间充质干细胞成软骨分化诱导培养基培养2周。所述人间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。所述TGF-β为TGF-β3。所述丙酮酸钠为life公司货号为11360070。所述ITS为invitrogen公司货号为41400-045。所述人间充质干细胞成软骨高效诱导分化培养基根据实际需要可添加其他成分,如1%体积百分比的非必需氨基酸,或1%体积百分比的抗生素。本发明提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基,可实现包括人骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞以及脂肪间充质干细胞在内的多种组织来源人间充质干细胞向成软骨细胞的高效诱导分化,成软骨分化特异性高。与现有技术诱导人间充质干细胞成软骨分化所需3-4周相比,本发明提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基可在使用3周内,使人间充质干细胞出现大量以二型胶原(collagenII)为代表的软骨组织细胞外基质,同时,使与成软骨效应密切相关黏蛋白(Glycosaminoglycan,GAG)蛋白表达水平显著上调,缩短人间充质干细胞成软骨分化诱导时间。此外,本发明提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基制备方法简便,使用方便,可实现稳定,高效的人间充质干细胞成软骨诱导分化。本发明的有益效果是:本发明能适应多种培养原料,诱导分化程度高,速度快,培养基制备方法方便,使用方便,过程稳定。附图说明图1为本发明不同配方的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基在诱导2周时对成软骨诱导分化相关基因CollagenII,Aggrecan的表达影响。图2为本发明不同配方的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基在诱导3周时对成软骨诱导分化相关基因CollagenII,Aggrecan的表达影响。图3为本发明P3代人骨髓间充质干细胞在本发明成软骨诱导分化培养基中诱导3周时成软骨诱导分化相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平。图4为本发明P3代人骨髓间充质干细胞在本发明成软骨诱导分化培养基中诱导3周时成软骨诱导分化阿尔辛蓝染色结果。图5为本发明P3代人脐带间充质干细胞在本发明成软骨诱导分化培养基中诱导3周时成软骨诱导分化相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平。图6为本发明P3代人脐带间充质干细胞在本发明成软骨诱导分化培养基中诱导3周时成软骨诱导分化阿尔辛蓝染色结果。图7为本发明P3代人脂肪间充质干细胞在本发明成软骨诱导分化培养基中诱导3周时成软骨诱导分化相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平。图8为本发明P3代人脂肪间充质干细胞在本发明成软骨诱导分化培养基中诱导3周时成软骨诱导分化阿尔辛蓝染色结果。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。本发明中所涉及对各个组分均为市场在售常规产品。具体实施案例中涉及成软骨诱导分化培养基信息如下:诱导分化培养基1:本发明实施例二中提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基。诱导分化培养基2:本发明实施例三中提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基。诱导分化培养基3:本发明实施例四中提供的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基。诱导分化培养基4:与诱导分化培养基1相比,不包含胰岛素生长因子-2。诱导分化培养基5:ThermoFisherScientific公司的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基,货号A1007101。实施例一:人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基的配方筛选本发明发明人通过大量实验对人间充质干细胞ru诱导分化培养基成分进行筛选。利用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养扩增人间充质干细胞。胰酶消化细胞,用专利权利要求中所述软骨诱导分化培养基重悬细胞,浓度为2X107个/mL;将10μL细胞悬液滴加到六孔板上,每孔5滴;将细胞在培养箱中放置2小时,每孔分别加入诱导分化培养基1、诱导分化培养基2、诱导分化培养基3,和诱导分化培养基4,每3天换液一次。分别在诱导2周和3周时,利用realtimePCR检测成软骨细胞相关基因CollagenII,Aggrecan表达水平。结果如图1和图2所示,通过在现有人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基中同时添加一定浓度的胰岛素生长因子-2(IGF-2),无论是在诱导培养后2周还是3周,都可显著上调成软骨相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平(与诱导分化培养基2、诱导分化培养基3,和诱导分化培养基4,p<0.01或p<0.05)。实施例二:人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基配制人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基,包括HG-MEM培养基,还有以下组分及其浓度:胎牛血清(FBS)10%(体积百分比)丙酮酸钠100mg/ml抗坏血酸50μg/ml脯氨酸20μg/ml地塞米松100nMITS1%(体积百分比)TGF-β35ng/ml胰岛素生长因子-2(IGF-2)20nM制备方法:向HG-MEM培养基中,按上述浓度加入FBS、丙酮酸钠母液、抗坏血酸母液、脯氨酸母液、地塞米松母液、ITS母液、TGF-β3母液,以及IGF-2母液,混合均匀,0.22μm滤膜过滤除菌即得。抗坏血酸母液配制:取50mg抗坏血酸,用α-MEM培养基溶解,配成50μg/μL的母液,-20℃保存。脯氨酸母液母液配制:取20mg脯氨酸,利用α-MEM培养基溶解,配制成20μg/μL母液,-20℃保存,。用地塞米松母液配制:取10g地塞米松,用95%乙醇溶解,配成100μm母液,-20℃保存。TGF-β3母液配:取5mgTGF-β3,用α-MEM培养基溶解,配成5μg/μL。制IGF-2母液配制:取2mgIGF-1,用α-MEM培养基溶解,配成2μM的母液,-20℃保存。实施例三:人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基,包括HG-MEM培养基,还有以下组分及其浓度:制备方法:与实施例二中所提供制备方法类似。实施例四:人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基,包括HG-MEM培养基,还有以下组分及其浓度:胎牛血清(FBS)10%(体积百分比)丙酮酸钠100mg/ml抗坏血酸20μg/ml脯氨酸10μg/ml地塞米松50nMITS1%(体积百分比)TGF-β31ng/ml胰岛素生长因子-2(IGF-2)40nM制备方法:与实施例二中所提供制备方法类似。实施例五:人骨髓间充质干细胞的成软骨诱导分化利用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养扩增人间充质干细胞。胰酶消化细胞,用专利权利要求中所述软骨诱导分化培养基重悬细胞,浓度为2X107个/mL;将10μL细胞悬液滴加到六孔板上,每孔5滴;将细胞在培养箱中放置2小时,每孔分别加入诱导分化培养基1和诱导分化培养基5,每3天换液一次。诱导2周后,用realtimePCR检测成软骨细胞相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平,如图3所示本发明中的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基所诱导分化细胞中的成软骨相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平更高(与诱导分化培养基5作用相比,p<0.01);同时利用阿尔辛蓝染色对成软骨程度进行鉴定,结果如图4所示,本发明中的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基所诱导分化细胞具有更为丰富软骨细胞外基质(与诱导分化培养基5作用相比)。上述结果说明本发明中的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基针对人骨髓间充质干细胞具有更好的成软骨诱导分化效果。实施例六:人脐带间充质干细胞的成软骨诱导分化利用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养扩增人间充质干细胞。胰酶消化细胞,用专利权利要求中所述软骨诱导分化培养基重悬细胞,浓度为2X107个/mL;将10μL细胞悬液滴加到六孔板上,每孔5滴;将细胞在培养箱中放置2小时,每孔分别加入诱导分化培养基1和诱导分化培养基5,每3天换液一次。诱导2周后,用realtimePCR检测成软骨细胞相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平,如图5所示本发明中的人间充质干细胞所诱导分化细胞中的成软骨相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平更高(与诱导分化培养基5作用相比,p<0.01);同时利用阿尔辛蓝染色对成软骨程度进行鉴定,结果如图6所示,本发明中的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基所诱导分化细胞具有更为丰富软骨细胞外基质(与诱导分化培养基5作用相比)。上述结果说明本发明中的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基针对人脐带间充质干细胞具有更好的成软骨诱导分化效果。实施例七:人脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化利用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养扩增人间充质干细胞。胰酶消化细胞,用专利权利要求中所述软骨诱导分化培养基重悬细胞,浓度为2X107个/mL;将10μL细胞悬液滴加到六孔板上,每孔5滴;将细胞在培养箱中放置2小时,每孔分别加入诱导分化培养基1和诱导分化培养基5,每3天换液一次。诱导2周后,用realtimePCR检测成软骨细胞相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平,如图7所示本发明中的人间充质干细胞培养基所诱导分化细胞中的成软骨相关基因CollagenII,Aggrecan的表达水平更高(与诱导分化培养基5作用相比,p<0.01);同时利用阿尔辛蓝染色对成软骨程度进行鉴定,结果如图8所示,本发明中的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基所诱导分化细胞具有更为丰富软骨细胞外基质(与诱导分化培养基5作用相比)。上述结果说明本发明中的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基针对人脂肪间充质干细胞具有更好的成软骨诱导分化效果。在于普通市场上的人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基相比,本发明具有明显的诱导速度快的特点,而且对人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞等不同来源的分化原料都具有更好的诱导分化效果,培养基制备方法方便,使用方便,过程稳定。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3 
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