本发明属于微生物领域，具体涉及一种牛分支杆菌esat-6蛋白及其制备方法。
背景技术：
早期分泌型蛋白esat-6是牛分支杆菌的主要免疫优势抗原，主要在牛分支杆菌感染早起分泌表达的一种抗原；卡介苗(bacilluscalmette-guérin，bcg)是可用于防治结核病的减毒活疫苗，使用活的无毒牛型结核杆菌(mycobacteriumbovis)制成，有足够高的免疫原性，可在一定程度上预防结核，但免疫动物后效果不稳定，动物机体接种bcg后会对皮内结核菌素反应的特异性产生严重干扰，因此用ppd皮试无法将疫苗接种与自然感染区分开来，但是卡介苗具有esat-6基因缺失，不能表达该蛋白，这一特征使其在牛分支杆菌导致的结核病早期诊断中有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明针对目前牛分支杆菌esat-6可溶性蛋白制备方法复杂的问题，提供了一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白及其制备方法。
本发明所述的枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白是通过以下方法制备得到的：将牛分支杆菌esat-6基因，插入到pnc-hise载体中，得到esat-6-pnc-hise表达载体，并将esat-6-pnc-hise表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，得到含esat-6-pnc-hise表达载体的阳性枯草芽孢杆菌，然后将上述阳性枯草芽孢杆菌单菌落经lb培养基培养后，接种到tm培养基，无需诱导，获得的菌液经纯化后得到融合表达的牛分支杆菌esat-6蛋白，所述牛分支杆菌esat-6基因序列如seqidno.1所示。
优选地，所述枯草芽孢杆菌在lb培养基中30～37℃培养至od600＝0.6～0.8，然后取菌液按1％的体积比例加入tm培养基，33～37℃培养48～64h，将菌液离心取上清，经纯化后获得融合表达的牛分支杆菌esat-6蛋白。
优选地，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌b.subtilisrik1285。
本发明所述的枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1)通过pcr方法获得牛分支杆菌esat-6基因序列，将其连接到pnc-hise载体中，得到esat-6-pnc-hise表达载体；所述牛分支杆菌esat-6基因序列如seqidno.1所示；
2)将esat-6-pnc-hise表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，在30～37℃培养16～20h后，得到含esat-6-pnc-hise表达载体的阳性枯草芽孢杆菌；
3)将含esat-6-pnc-hise表达载体的阳性枯草芽孢杆菌的单菌落接种于lb培养基中，30～37℃培养至od600＝0.6～0.8，取菌液按1％的体积比例加入tm培养基中，无需诱导，33～37℃培养48～64h，离心取上清，并对上清进行纯化，得到融合表达的牛分支杆菌esat-6蛋白。
进一步地，步骤1)所述pcr方法用的模板为患肺结核病鹿的肺脏组织dna，上游引物序列如seqidno.2所示；下游引物序列如seqidno.3所示。
优选地，所述pcr获得的牛分支杆菌esat-6基因经bamhi与ecori双酶切后与经同样酶切后的pnc-hise载体dna进行连接。
优选地，步骤2)所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌b.subtilisrik1285。
优选地，步骤3)所述纯化是利用histrapffcrude柱纯化进行的，具体是指用含有10mm咪唑的柱结合液洗3～5cv，再用含500mm咪唑的柱洗脱液洗脱获得esat-6蛋白。
所述柱结合液配方为：20mm磷酸钠、500mm氯化钠和10mm咪唑，ph7.4；柱洗脱液配方为：20mm磷酸钠、500mm氯化钠和500mm咪唑，ph7.4。
本发明还提供了一种表达牛分支杆菌esat-6蛋白的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌含有esat-6-pnc-hise表达载体，所述esat-6-pnc-hise表达载体是由牛分支杆菌esat-6基因，经bamhi与ecori双酶切后，与经同样酶切的pnc-hise载体大片段连接获得的，所述牛分支杆菌esat-6基因序列如seqidno.1所示。
有益效果
本发明可以快速简便的获得大量枯草芽孢杆菌表达的esat-6可溶性蛋白，解决了其它方法获得枯草芽孢杆菌表达的esat-6可溶性蛋白需要大量诱导并要透析的复杂过程。
附图说明
图1表达esat-6蛋白基因的pcr结果图，其中，1为marker，2为esat-6基因。
图2esat-6-pnc-hise表达载体的pcr和酶切鉴定，1为含表达载体的质粒，2为pcr鉴定产物，3为酶切产物，4、5为marker。
图3his-esat-6sds-page鉴定结果，1为纯化的esat-6蛋白，2为蛋白质marker。
图4his-esat-6纯化结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白及其制备方法，该蛋白是通过以下方法制备得到的：将牛分支杆菌esat-6基因的pcr扩增产物连接到pnc-hise表达载体中，得到表达载体esat-6-pnc-hise，将表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，经pcr和限制性内切酶酶切鉴定，得到含表达载体的阳性枯草芽孢杆菌；将该阳性枯草芽孢杆菌单菌落接种于培养基中培养，不需诱导即可分泌表达，离心取上清，对上清进行纯化、检测，得到目的蛋白。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
所述胶回收试剂盒购于上海普洛麦格生物产品有限公司，pnc-hise载体购自takara公司，codeno.hb123，10×t4连接酶buffer、t4连接酶购于美国thermo公司，枯草芽孢杆菌感受态细胞b.subtilisrik1285购自宝生物工程(大连)有限公司，细菌基因组dna提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，cat#dp2001，akatapruifier10蛋白质纯化系统购买自gehealth。
所述lb培养基(/l)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g。
所述tm培养基(/l)：葡萄糖10g，蛋白胨10g，艾希氏松鱼提取物5g，酵母粉2g，七水合硫酸亚铁10mg，四水合硫酸镁10mg，七水合硫酸锌1mg。
所述rm培养基：每升lb培养基中添加0.5m山梨醇，0.38m甘露醇制备获得。
实验中涉及的其他试剂或酶如未特别说明，则是商业化产品。
实施例1.枯草芽孢杆菌表达的esat-6蛋白的制备方法。
下面具体描述枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白的制备方法。
1)表达载体esat-6-pnc-hise的构建：
通过pcr方法获得牛分支杆菌esat-6基因序列，将其连接到pnc-hise载体中，得到esat-6-pnc-hise表达载体；所述pcr所用上游引物为esat-6-f：5’gttccacgtggatccgtc3’，如seqidno.2所示；下游引物esat-6-r：为5’caagaattcttacatccc3’，如seqidno.3所示。pcr扩增所用模板来自肺结核鹿的肺组织中粗分离的牛分支杆菌中提取的dna，记载在：李海涛,刘艳环,李艳,王志刚,苗利光.牛分支杆菌esat-6基因的克隆与序列分析[j].特产研究,2008,30(04):10-13.dna材料保藏于中国农业科学院特产研究所，公众可从申请日起二十年内从本实验室获取。
pcr反应体系为：上游引物：2.5μl；下游引物：2.5μl；dntp(各3.2μmol/1.28ml)：4μl；25mmmgcl2：6μl；10*buffer：5μl；taqse：0.3μl；ddh2o：28.7μl；dna模板：浓度为10ng/μl，1μl。pcr反应条件：95℃5min，1循环；94℃1min；52℃40s；72℃1min30s，30循环；72℃5min，1循环。
pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得了300bp附近的条带，如图1所示，将上述pcr产物经胶回收试剂盒回收纯化。
将获得的esat-6基因片段用bamhi与ecori进行双酶切，酶切体系如下：
esat-6基因pcr回收产物6μl，bamhi3μl，ecori3μl，10×fastdigestbuffer5μl，ddh2o至50μl，混匀，9000rpm离心5s，37℃酶切2h，加入10×loadingbuffer终止反应。
pnc-hise载体dna用bamhi与ecori进行双酶切，酶切体系如下：
pnc-hise载体≤2μg；bamhi3μl；ecori3μl；10×fastdigestbuffer5μl；ddh2o至50.0μl；混匀，9000rpm离心5s，37℃酶切2h，加入10×loadingbuffer终止反应。
胶回收试剂盒回收5240bp大片段，然后将上述pcr产物酶切片段与pnc-hise载体酶切后大片段相连接，连接体系如下：
连接反应(20μl体系)：
混匀，9000rpm离心5s，22℃连接10min，得到连接产物，即质粒esat-6-pnc-hise，所述牛分支杆菌esat-6基因序列如seqidno.1所示。
2)esat-6-pnc-hise表达载体转化枯草芽孢杆菌：
将esat-6-pnc-hise表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，在30～37℃培养16～20h后，得到含esat-6-pnc-hise表达载体的阳性枯草芽孢杆菌。
转化方法如下所述：
①取出制备好的枯草芽孢杆菌感受态细胞，放在冰水上融化。
②每100μl感受态细胞加上述连接产物：质粒esat-6-pnc-hise5μl、ddh2o1μl，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上孵育10min。
③将电转杯放置冰上预冷。
④将感受态与连接产物的混合物加入电转杯，冰上孵育10min，2.5kv，电击一次。
⑤将电击后产物以及阴性对照分别加入1mlrm培养基，37℃，200rpm震荡复苏3h。
⑥将连接后转化产物100μl，阴性对照100μl，均匀涂布于含有50μg/ml新霉素的平板上。
⑦倒置培养皿，于37℃培养过夜，得到转化子。
转化子的鉴定：
挑取2～3个克隆，转移至新的lb平板，并做菌落pcr鉴定。
菌落pcr反应体系及条件(50μl体系，温度和时间根据片段大小适当调整)：
上游引物：2.5μl；下游引物：2.5μl；dntp(各3.2μmol/1.28ml)：4μl；25mmmgcl2：6μl；10*buffer：5μl；taqse：0.3μl；ddh2o：28.7μl；菌液：1μl。混匀，9000rpm离心5秒。
pcr反应条件：
95℃5min，1循环；94℃1min；52℃40s；72℃1min30s，30循环；72℃5min，1循环。
取10μl菌落pcr产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳30min，紫外观察可见300bp附近的条带，说明esat-6基因已成功克隆入载体中。
挑取鉴定为阳性菌落，接种于25mllb(含50μg/ml新霉素)液体培养基中，37℃220rpm培养过夜。取部分菌液进行pcr鉴定，剩余保存菌种。
菌液pcr体系(50μl)：
上游引物：2.5μl；下游引物：2.5μl；dntp(各3.2μmol/1.28ml)：4μl；25mmmgcl2：6μl；10*buffer：5μl；taqse：0.3μl；ddh2o：28.7μl；菌液：1μl；混匀，9000rpm离心5秒。
pcr反应条件：
95℃5min，1循环；94℃1min，52℃40s，72℃1min30s，30循环；72℃5min，1循环。
电泳检测：取10μl菌液pcr鉴定产物，点样于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外观察可见300bp附近的条带。
酶切鉴定：取1ml菌液，小剂量提取质粒，然后用限制性内切酶bamhi和ecori进行双酶切鉴定，反应体系为：
质粒20μl；bamhi3μl；ecori3μl；10×fastdigestbuffer5μl；ddh2o至50.0μl
混匀，37℃酶切2h，加入10×loadingbuffer终止反应，图2所示为阳性转化子中esat-6基因pcr检测及质粒酶切检测图，由图2可知，本发明所述的esat-6-pnc-hise载体已成功转化入枯草芽孢杆菌。
3)牛分支杆菌esat-6蛋白分离与纯化：
将步骤2)获得的阳性枯草芽孢杆菌单菌落接种于5mllb培养基中，30～37℃培养16～20h，至od600＝0.6～0.8，取菌液按1％的体积比例加入tm培养基中，无需诱导，33～37℃培养48～64h，离心取上清，利用akatapruifier10蛋白质纯化系统，按照该产品说明书进行操作，通过histrapffcrude柱纯化法对上清进行纯化：用含有10mm咪唑柱结合液洗3～5cv，用含500mm咪唑的柱洗脱液洗脱获得esat-6蛋白，所述柱结合液配方为：20mm磷酸钠、500mm氯化钠和10mm咪唑，ph7.4；柱洗脱液配方为：20mm磷酸钠、500mm氯化钠和500mm咪唑，ph7.4。
经sds-page电泳检测，得到融合his标签的esat-6蛋白，分子量约为11kda，如图3、图4所示。本发明方法制备的esat-6蛋白的纯度为95％以上。
sequencelisting
<110>中国农业科学院特产研究所；石家庄市兽用生物制品供应站
<120>一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白及其制备方法
<130>
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
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<212>dna
<213>esat-6基因
<400>1
caccatcaccatcaccatctggttccacgtggatccgtcgatctagactcgaggcggaat60
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gaaatgtcacgtccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcg180
cagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacg240
ccacggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccg300
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<400>3
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