本发明涉及基因工程领域，主要涉及一种硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm及其制备方法和应用。
背景技术：
硫酸岩藻聚糖或岩藻聚糖硫酸酯是一种分子量较高的水溶性杂多糖，主要存在于褐藻(如海带、墨角藻等)和一些海洋无脊椎动物(如海参、海胆等)中。它主要由硫酸化l-岩藻糖(岩藻糖的2/3/4位羟基硫酸化)组成，一些还含有半乳糖、甘露糖、糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖、木糖等单糖以及乙酰基等组分(alemt,etal.,mar.drugs,2011,9,2106-2130)。褐藻来源硫酸岩藻聚糖的结构非常复杂，包括硫酸化和乙酰化的位置与数量以及支链结构等，只有一部分硫酸岩藻聚糖的平均或部分结构比较清楚。褐藻来源硫酸岩藻聚糖的主链主要包括两种类型结构骨架：类型i只由α-1→3-岩藻糖苷键组成，类型ii由交替α-1→3-和α-1→4-岩藻糖苷键组成。来源于海洋无脊椎动物硫酸岩藻聚糖的结构相对简单些，线性主链主要由α-1→3-或α-1→4-岩藻糖苷键组成，并且有一定的规律性，由重复的硫酸化岩藻单或三或四糖等结构单元组成。许多研究表明，硫酸岩藻聚糖具有抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗血栓、降血脂、提高免疫力、抗菌、抗病毒、抗补体等活性(holtkampad,etal.,appl.microbiol.biotechnol.,2009,82,1-11)。
尽管硫酸岩藻聚糖具有多种活性，但是硫酸岩藻聚糖的结构多样性、高分子量、粘稠性等特点可能限制它们的应用，尤其在治疗方面。若将硫酸岩藻聚糖降解为低分子量寡糖，便能克服这些问题，这也是解决其构效关系的有效手段。研究证明，低分子量硫酸岩藻寡糖也表现出了很好的抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、抗血小板、提高免疫力、抗病毒、预防肾小管间质纤维化等活性。因此，硫酸岩藻寡糖更具有开发为药物的潜力。对硫酸岩藻聚糖进行可控降解是实现其活性应用及研究其结构-活性关系的关键(chench,etal.,sci.rep.,2017,40183)。
和其它寡糖的制备类似，硫酸岩藻寡糖的制备方法也主要有物理法、化学法和酶法。物理降解方法包括微波、超声波等方法，虽然操作简单、容易控制，但降解效率较低且降解程度有限，通常需要与其他降解方法联合使用。化学降解法主要包括酸水解和氧化降解，通常需要在剧烈条件下进行，存在可控性与重复性较差、环境污染以及需要特殊的反应设备等问题。研究证明，硫酸基的含量及位置对硫酸岩藻聚糖及寡糖的活性有重要影响。而化学降解法很容易导致硫酸基也被脱除，因此将严重影响降解产物的活性。酶解法是利用水解酶或裂解酶特异性的降解硫酸岩藻聚糖，获得低分子量的寡糖。酶解法具有特异性高、产物均一性好、反应条件温和、工艺易于控制、可重复性高、副反应少、环境友好等优点，是理想降解硫酸岩藻聚糖的方法。最重要的是在降低分子量的同时不会对硫酸基的含量和位置产生影响，因此不会对降解产物-硫酸岩藻寡糖的活性产生影响(holtkampad,etal.,appl.microbiol.biotechnol.,2009,82,1-11)。
目前针对硫酸岩藻多糖降解酶研究的报道还比较少，市场上还未见商品化的硫酸岩藻多糖降解酶制剂，同时市场上还未见利用生物法制备的硫酸岩藻寡糖产品(kusaykinmi,etal.,glycobiology,2016,26,3-12)。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种截短的硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm及其编码基因。
本发明的另一目的是提供包含一种截短的硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm编码基因的重组载体以及高效表达硫酸岩藻多糖裂解酶的重组菌株。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm，其氨基酸序列如seqidno.4所示。
本发明还提供了一种硫酸岩藻多糖裂解酶基因，编码上述硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm。进一步优选地，所述基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。
本发明还提供了包含上述硫酸岩藻多糖裂解酶基因的重组表达载体，优选重组表达载体为pet28a-tflfm。
本发明还提供了包含上述重组表达载体的重组菌株。进一步优选地，所述重组菌株为大肠杆菌bl21(de3)。
本发明的上述硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm的制备方法，包括以下步骤：
1)构建表达编码硫酸岩藻多糖裂解酶的n-端催化结构域的基因序列，获得上述硫酸岩藻多糖裂解酶基因，然后构建上述重组载体；
2)用步骤1)的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
3)培养重组菌株使其发酵，诱导硫酸岩藻多糖裂解酶表达；
4)回收并纯化所表达的硫酸岩藻多糖裂解酶。
本发明还提供了上述硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm在降解硫酸岩藻多糖中的应用。
由于编码完整的来源于海洋细菌黄杆菌科细菌fucobactermarinasa-0082的硫酸岩藻多糖裂解酶flfm(fucoidanlyasefromfucobactermarina)的基因(genbanknoaao00510.1)在大肠杆菌中表达时，主要形成包涵体，无法得到可溶性蛋白质。
通过ncbi(thenationalcenterforbiotechnologyinformation)的保守结构域数据库(ccd，theconserveddomaindatabase)，对flfm进行保守结构域预测，flfm包括n-端功能未知的结构域、f5/8类型c结构域(也称为盘菌素结构域)和c-端的por_secre_tail结构域(c-端排列结构域，可能和蛋白质在细菌表面的排列或共价结合相关)。基于此，我们推测n-端功能未知的结构域可能为催化结构域，因此本发明构建了只编码n-端催化结构域的基因(编码n-端的447个氨基酸)，构建了一株高效表达截短的硫酸岩藻多糖裂解酶的重组菌株。通过基因工程技术，在大肠杆菌bl21(de3)中转入编码截短的硫酸岩藻多糖裂解酶基因的表达质粒pet28a-tflfm(truncatedflfm)，得到重组大肠杆菌bl21(de3)。
所述的表达质粒pet28a-tflfm由n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶基因和表达载体pet-28a载体组成。将所述表达n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶基因的质粒pet28a-tflfm导入到大肠杆菌bl21(de3)菌株中进行高效表达，目的蛋白质的产量达到了～100mg/l，并通过体外实验证实了所述的硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm的酶活。
本发明所具有的优点：本发明的截短的硫酸岩藻多糖裂解酶能够专一降解硫酸岩藻多糖的酶，为硫酸岩藻多糖的降解提供了一种工具酶。本发明通过构建n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶基因，进一步构建了一株高效表达截短的硫酸岩藻多糖裂解酶的重组菌株使硫酸岩藻多糖裂解酶在菌株可以高效表达，且不形成包涵体。
附图说明
图1为本发明n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶基因的表达质粒结构示意图。
图2为本发明表达n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶镍柱纯化的sds-page电泳图(框内的条带为纯化的目的蛋白质tflfm)。
图3为本发明表达n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶催化反应产物的hplc图(实线—：酶催化反应；虚线…：对照，不加酶)(箭头处为催化反应产物)。
图4为本发明表达n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶催化反应产物的一级质谱图(箭头处为催化反应产物的分子量：563.348，预测分子量564.47)。
图5为本发明表达n-端截短的硫酸岩藻多糖裂解酶催化反应产物的二级质谱图(563.348的二级质谱图)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明中质粒提取采用omega公司plasmidminikiti试剂盒(d6943-01)bl21(de3)感受细胞来自中国科学院过程工程研究所糖生物工程课题组。
实施例1完整硫酸岩藻多糖裂解酶flfm表达菌株的构建
本发明参照编码硫酸岩藻多糖裂解酶的基因(genbankno：aao00510.1)，通过密码子优化，委托生物工程(上海)股份有限公司合成了编码硫酸岩藻多糖裂解酶(不包括信号肽)的基因，共有2022个碱基，核甘酸序列如seqidno.1所示，克隆载体为pet28a，克隆位点ndei和xhoi，载体抗性为卡那霉素(kan)，优化物种e.coli(图1)。对携带表达质粒pet28a-flfm的大肠杆菌dh5α进行培养，使用plasmidminikiti试剂盒提取质粒，然后将表达质粒导入感受态大肠杆菌bl21
(de3)中，获得重组菌株。氨基酸序列如seqidno.2所示，含有673个氨基酸，预测蛋白分子量为73.0kda。
seqidno.1
(1)序列特征
长度：2022bp
类型：碱基序列
链型：双链
拓扑结构：线性
(2)分子类型：dna
(3)假设：否
(4)反义：否
(5)最初来源：aao00510.1
(6)特异性名称：硫酸岩藻多糖裂解酶基因
seqidno.2
(1)序列特征
长度：673
类型：氨基酸序列
(2)分子类型：蛋白质
(3)假设：否
(4)反义：否
(5)最初来源：aao00510.1
(6)特异性名称：硫酸岩藻多糖裂解酶。
实施例2完整硫酸岩藻多糖裂解酶flfm的表达与检测
(1)配制含有kan抗性的lb培养基：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，120℃灭菌20min，冷却到室温加入kan使其终浓度50μg/ml。
(2)将实施例1得到的重组菌株，接种到含有kan抗性的固体lb培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种到5ml含有kan抗性的液体lb培养中，37℃，200rmp摇床培养24小时后，将上述菌液接种到500ml含有kan抗性的液体lb培养中，37℃、200rmp床培养至od600nm＝0.6时，加入0.5mmiptg，16℃、200rmp诱导表达24小时，5000rmp离心，收集菌体。
(3)取少量菌体进行sds-page分析，上清溶液中没有检测到目的蛋白质的表达；通过westernblot分析，仅检测到少量目的蛋白质的存在。
实施例3n-端截短硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm表达菌株的构建
以f1(5’-cggcgccatatgcagactactaccgtatacag-3’)和r1(5’-acgggcctcgagttaatcggagtcgcagtcaatcgc-3’)作为引物对，以质粒pet28a-flfm作为模板进行pcr，将pcr产物和表达载体pet28a分别经ndei和xhoi酶切，回收目的片段，将基因片段和载体片段连接得到质粒pet28a-tflfm(图1)。对携带表达质粒pet28a-tflfm的大肠杆菌dh5α进行培养，使用plasmidminikiti试剂盒提取质粒，然后将表达质粒导入感受态大肠杆菌bl21(de3)中，获得重组菌株。核甘酸序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示，含有447个氨基酸，预测蛋白分子量为48.0kda。
seqidno.3
(1)序列特征
长度：1344bp
类型：碱基序列
链型：双链
拓扑结构：线性
(2)分子类型：dna
(3)假设：否
(4)反义：否
(5)最初来源：aao00510.1
(6)特异性名称：截短的硫酸岩藻多糖裂解酶基因。
seqidno.4
(1)序列特征
长度：447
类型：氨基酸序列
(2)分子类型：蛋白质
(3)假设：否
(4)反义：否
(5)最初来源：aao00510.1
(6)特异性名称：截短的硫酸岩藻多糖裂解酶。
实施例4n-端截短硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm的表达、纯化与检测
(1)将实施例3收集到菌体，悬浮到缓冲溶液a(50mmtri-hcl，ph7.9，500mmnacl)中进行超声破碎，12000rmp离心收集上清，进行sds-page检测(图2)预测蛋白分子量48.0kda。
(2)使用镍柱对上述蛋白进行纯化：
1.缓冲溶液a(50mmtris/hcl,ph8.0,0.5mnacl)平衡柱子，流速1ml/min。
2.上样，流速1ml/min，收集穿透。
3.缓冲溶液a洗涤柱子，流速1ml/min，洗涤30ml，
4.缓冲溶液a+20mm咪唑洗脱，流速1ml/min，洗涤30ml，每5min收集一管。
5.g250检测收集样品，看最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白，则进行下一浓度咪唑洗脱
6.缓冲溶液a+60mm咪唑洗脱，流速1ml/min，洗涤30ml，每5min收集一管。
7.g250检测收集样品，看最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白则进行下一浓度咪唑洗脱
8.缓冲溶液a+100mm咪唑洗脱，流速1ml/min，洗涤30ml，每5min收集一管。
9.g250检测收集样品，看最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白，则进行下一浓度咪唑洗脱
10.缓冲溶液a+160mm咪唑洗脱，流速1ml/min，洗涤30ml，每5min收集一管。
11.g250检测收集样品，看最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白，则进行下一浓度咪唑洗脱。
12.缓冲溶液a+200mm咪唑洗脱，流速1ml/min，洗涤30ml，每5min收集一管。
13.g250检测收集样品，看最后一管是否还有蛋白被洗脱下来，若没有蛋白，则进行下一浓度咪唑洗脱
14.选取每个咪唑浓度洗脱蛋白含量高的组、原液、上样穿透、缓冲溶液a洗脱，进行sds-page分析(图2)。
合并比较纯的硫酸岩藻多糖裂解酶组分，用14,000da的透析袋进行透析。
在本实施例中，n-端截短硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm在大肠杆菌中获得高效表达，纯化的蛋白质产量达到了～100mg/1l培养基，为硫酸岩藻多糖裂解酶的应用开发奠定了基础。
实施例5n-端截短硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm的酶活分析
100μl岩藻多糖(10mg/ml)溶液(溶解在50mm磷酸钠缓冲液，ph7.5)，加入10μl4mnacl，10μln-端截短硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm(8mg/ml)，在37℃，200rpm/min反应6小时。然后100℃水浴加热10min，12000rpm/min离心5min，取上清，进行hplc分析(图3)：acchroms6000hplc系统，xamide柱子(4.6mm×250mm,5μm)，流动相包括水(a)、乙腈(b)和甲酸铵(c)，梯度洗脱条件：0-40min，90-50％(b)，10％(c)，流速1.5ml/min，柱温40℃。
收集hplc25分钟左右的峰，冷冻干燥后溶解在少量水中，把样品与基质dhb混合后，用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪maldi-tof/tofultraflextremetm(brucker,germany)在反射模式下进行分析(图4)，对563.348处的峰进行二级质谱分析(图5)。
本实施例中，n-端截短硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm表现出了很好的降解岩藻多糖的活性，为硫酸岩藻多糖裂解酶的应用开发提供了铺垫。
当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。
序列表
<110>中国科学院过程工程研究所
<120>一种硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm及其制备方法和应用
<150>2017110582905
<151>2017-11-01
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2022
<212>dna
<213>artificial
<400>1
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<211>673
<212>prt
<213>artificial
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<400>3
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cgtgcatataacgcaggtactacttacatcgacggcgtggaaattcagcgtgcaactgac780
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