本发明涉及一种核酸扩增技术及基于该技术的检测技术，特别涉及基于crispr-链取代的等温扩增及检测技术。
背景技术：
：核酸分子基于其生物特性被视为重要的生物标志物。核酸分子的检测在医学诊疗、食品安全、公共卫生和社会安全等方面有着广泛的应用。通常，在核酸检测过程中，待检样品中的靶核酸分子浓度极低，而非靶核酸分子浓度则较高。因此，对待检测样品中的靶核酸分子特异性扩增是提高核酸检测反应的灵敏度和准确度的常用方法。目前，通过pcr扩增技术特异性地扩增待检测样品中的靶核酸分子(dna)片段是核酸检测中使用的最主要的技术，也是目前最有效、最直接的方法。然而，pcr技术目前仍具有诸多难以克服的限制，例如：1)对模板dna纯度要求高；2)对反应条件敏感，而实际待检测样品中往往存在对pcr反应有抑制作用的成分；3)扩增反应需经历多重变温反应，反应时间较长；4)检测反应所需设备及结果分析设备成本较高，只能在实验室完成；以及5)检测所需试剂成本高，且使用操作需经过专业培训，相关检测需耗费大量人力物力成本。同时，在医学诊疗、食品安全相关的实际检测中，需要开展实地检测，并尽可能在短的时间内获得靶核酸分子的检测结果。因此，基于pcr技术的核酸检测手段无法满足实际应用的需求，新的低成本，高效快速的核酸检测手段将因此具有广泛的应用潜力。针对上述问题，研究人员开发出了一系列核酸的等温扩增技术(isothermalamplification)以解决pcr扩增技术中面临的诸多问题。针对于dna的检测，通常利用具有链取代功能的聚合酶(如klenowfragment，bst，等)，在有切口酶(如sda技术)或无切口酶(如lamp、rca、hda和rpa等技术)参与下，在1-2小时内将靶dna的扩增至可被检测的水平(isothermalinvitroamplificationofdnabyarestrictionenzyme/dnapolymerasesystem,walkergt等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1992,89(1):392–396；loop-mediatedisothermalamplificationofdna,notomit等,nucleicacidsres.,2000,28(12):e63；rollingreplicationofshortdnacircles,firea等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1995,92(10):4641–4645；helicase-dependentisothermaldnaamplification,vincentm等,emborep.,2004,5(8):795–800；dnadetectionusingrecombinationproteins,piepenburgo等,plosbiol.,2006,4(7):e204)。对于rna样品，则通常先利用逆转录酶将rna逆转录为dna，再以dna为模板进行等温扩增(如nasba和smart等技术)(isothermal,invitroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodeledafterretroviralreplication,guatellijc等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1990,87(5):1874–1878；specificdetectionofdnaandrnatargetsusinganovelisothermalnucleicacidamplificationassaybasedontheformationofathree-wayjunctionstructure,wharamd等,nucleicacidsres.,2001,29(11):e54)。等温扩增技术在反应过程中不依赖于温度变化或热循环过程完成核酸扩增，因此可显著缩短扩增时间，并降低扩增反应的仪器成本。同时，由于大多数等温扩增体系对常见的pcr反应抑制剂不敏感，其样品的预处理过程可进一步简化，进一步降低了相应的操作难度和复杂程度。这些特征使得等温扩增技术被广泛应用在诸如传染病检测、食品致病菌检测、转基因作物检测等方面，并被逐渐发展成为成熟的商品化试剂盒。然而，目前的大多数商业化的等温扩增技术仍有一些尚未克服的缺陷，例如，引物设计较为复杂(如lamp技术)，以及无法区别核酸序列中单核苷酸的差异等。因此，新的快速、高效、高灵敏度的核酸检测手段具有重要的应用价值。crispr(clusteredregularlyinterspersedshortpalindromicrepeats，规律成簇间隔短回文重复)是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。cas9蛋白是crispr系统的效应蛋白，其作为一种rna导向的双链dna结合蛋白，是目前已知的第一个统一因子，能够特异性地精确定位及编辑基因组中的几乎任何双链dna序列。crispr-cas9技术的应用截至目前仍主要集中在基因编辑和基因治疗两个方面。基于该技术所具有的低成本、体系简单、高效率、高特异性及高灵敏度等特点，其在核酸检测领域技术应该具有同样广泛的应用前景。利用crispr技术对靶核酸分子进行检测近期已开始见于报道。cn105177110a公开了一种基于cas9融合蛋白对目标核酸进行检测的体外方法，该方法即在靶核酸序列存在的情况下，通过与靶序列特异性结合，由一对cas9融合蛋白共同产生可被检测的荧光信号。另有报道利用crispr效应蛋白cas13a特异性检测rpa技术扩增后的核酸产物(nucleicaciddetectionwithcrispr-cas13a/c2c2,gootenbergjs等,science,2017,356(6336):438-442)。然而，这些技术都是基于现有的等温扩增技术先对靶dna分子进行扩增，再以crispr技术进行检测。以crispr技术为起始进行靶核酸特异性扩增的方法尚未见于报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供基于crispr-链取代的等温扩增试剂盒及方法。本发明所采取的技术方案是：一种基于crispr-链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，试剂盒还包括了野生型cas9和/或核酸酶缺陷的cas9切口酶、特异性识别目标dna序列上下游的sgrna对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与cas9-sgrna复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，核酸酶缺陷的cas9切口酶为hnh核酸酶缺陷的cas9切口酶。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，sgrna对的识别位点分别为目的序列上游ccn序列3’端的10～30个核苷酸序列和下游ngg序列5’端的10～30个核苷酸序列。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，sgrna对识别位点的间距100～1000bp，优选100～250bp，识别位点5’端以ccn为起点，3’端靶序列以ngg为终点。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，链取代等温扩增试剂的dna引物具有如下特征：该引物5’端包含了一个切口酶识别位点，且该位点的酶切位点在其互补链上；该引物的中段与cas-sgrna复合体所识别的靶dna区域的ngg序列所在链的至少10个连续核苷酸互补配对。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，链取代等温扩增试剂的dna引物的3’端包含了一段1～10个核苷酸的与ngg序列所在链核苷酸互补的序列。一种基于crispr-链取代的核酸检测试剂盒，包括上述的等温扩增试剂盒，以及核酸定量分析试剂。核酸定量分析试剂选自特异性分子信标分子。基于crispr-链取代的等温扩增方法，包括如下步骤：1)获取待测样品核酸；2)使用上述等温扩增试剂盒含有的试剂对待测核酸样品进行扩增。基于crispr-链取代的等温扩增检测方法，包括如下步骤：1)获取待测样品核酸；2)使用上述等温扩增试剂盒含有的试剂对待测核酸样品进行扩增；3)对扩增产物进行分析，确定检测结果。本发明的有益效果是：1)本发明的技术主要利用crispr-cas9系统可特异性识别3’端具有-ngg序列的任意dna序列这一特点，其特征在于，可精确定位基因组中几乎任何目的片段，且复合体构建非常简便。就理论计算而言，在一段待检测dna中，每8个碱基即可出现一次-ngg序列。因此，上下游dna靶序列(即cas9-sgrna复合体识别位点)的设计在实际检测中广泛分布。同时，由于cas9-sgrna复合体的靶向作用完全取决于sgrna分子5’端的20个碱基的区域，构建针对上下游dna靶序列的cas9-sgrna复合体非常简便。2)本发明的技术利用的crispr-cas9系统对靶dna的识别反应迅速，特异性高。目前已被证明，crispr-cas9系统对靶dna识别结合的解离常数在10-9-10-10m量级，结合反应时间在5-10分钟内完成，与大多数抗体的特征相似，从而使本发明的等温扩增体系反应迅速，并具备极高的特异性。同时，用于等温扩增反应的引物对在crispr-cas9系统对待检测dna完成切割前无法引起等温扩增反应的进行，这一特点进一步提高了本发明的等温扩增体系的特异性。3)本发明的技术无需依赖退火或变温步骤即可在同一温度(优选的37℃)进行针对rna，单链dna和双链dna的检测。在用于rna检测时，仅需用针对靶rna的引物进行rna逆转录，再对转录产物cdna合成互补dna进而形成双链dna后进行等温扩增检测。而在用于单链dna检测时，则仅需用针对靶dna的引物进行互补链合成即可进行等温扩增检测。4)本发明的技术反应条件简单，扩增效率高的特点。由于不依赖于初始退火步骤，且在整个检测过程中仅需维持同一温度这些特点使得本发明的等温扩增体系无需复杂变温设备，使得检测反应简单可控，检测成本低。同时，通过和链取代反应结合，本发明的等温扩增体系可在1-2小时内对极低量的靶dna(10-16m)完成106-109倍的扩增。5)本发明的技术中，crispr-cas9系统和链取代反应系统对传统的pcr反应抑制剂不敏感，本发明的等温扩增体系对各种杂质成分具有很好的抗干扰性。附图说明图1是基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应机理示意图；图2是基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应特异性检测短dna模板的电泳检测结果；图3是基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应特异性检测人基因组中小片段dna的电泳检测结果；图4是基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应特异性检测短dna模板的实时荧光检测结果；图5是基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应在高污染物背景下特异性检测人基因组中小片段dna的电泳检测结果。具体实施方式下面结合图1对本发明的技术机理作详细说明。本基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应从功能上分为3个独立反应步骤，即cas9-sgrna复合体特异性结合dna靶序列对(cas9结合反应)，扩增引物与dna靶序列区域被cas9-sgrna复合体结合后暴露出的单链区域结合(引物结合反应)，结合后的扩增引物在等温扩增酶类作用下实现指数倍等温扩增(链取代等温扩增反应)。(一)cas9结合反应本步骤通过在待检测体系中引入特异性识别dna靶序列对的cas9-sgrna复合体，为检测引物提供结合位点及扩增反应起始位点。由于cas9-sgrna复合体与其dna靶序列的结合识别反应与大多数抗体-抗原结合反应类似，具有反应迅速，特异性高等特点，从而使本发明的等温扩增体系反应迅速，并具备极高的特异性。同时，由于本发明引入了上下游两个dna靶序列作为扩增起始反应的先决条件，使得潜在的单一脱靶识别反应无法进一步引起下游的链取代扩增反应，这一特点进一步提高了本发明的等温扩增体系反应的特异性。具体的方法是，在一定的离子浓度(nacl或kcl，50～300mm)和ph范围(ph6～8.5)条件下，通过向待检测样品中引入一定浓度的cas9-sgrna复合体对(10nm～200nm)，在特定温度下(室温～45℃)孵育15分钟，即可完成针对dna靶序列对的结合识别反应。其优势在于，cas9-sgrna复合体对dna靶序列的识别反应对于反应条件要求较低，可在较大范围的离子浓度，ph，和温度条件下迅速完成。(二)引物结合反应本步骤通过在上述反应体系中引入特异性引物对，为下一步指数倍等温扩增反应提供作用位点。前期的研究工作发现，cas9-sgrna复合体对dna靶序列特异性结合后，会将靶dna双链的非模板链与模板链分离，并暴露于周围溶液环境中。这一特点为提供了扩增引物的结合位点。通过设计一对分别于被暴露于溶液中的dna靶序列对特异性结合的引物对，并在引物对的5’端区域引入切口酶作用位点，为下一步链取代反应提供起始作用位点。该单链区域与引物特异性结合后会形成一个引物的5’突出端。这一设计的优势在于：第一，对于cas9-sgrna复合体脱靶识别反应，由于其dna序列与靶dna序列的差异性，引物通常无法与被脱靶反应所暴露的单链dna互补结合，从而无法有效引起下游的链取代扩增反应；第二，下游的链取代指数倍扩增反应要求cas9-sgrna复合体对同时识别待检测dna的上下游dna靶序列，进一步提高了本发明的等温扩增体系的特异性；第三，引物对与被暴露的单链dna区域的结合反应迅速，无需变温，提高了本发明的等温扩增体系的效率。具体的方法是，待cas9结合反应完成后，向该反应体系中加入少量高浓度扩增引物对(终浓度50～200nm)，并在特定温度下(室温～45℃)短暂孵育(10秒钟～10分钟)，即可完成引物结合反应。(三)链取代等温扩增反应本步骤通过在上述反应体系中引入链取代等温扩增反应酶类，从而实现对上下游dna靶序列间的区域的指数倍扩增。在引入链取代等温扩增反应酶类后，其先通过链延伸反应补平暴露的单链dna区域与引物结合后形成的5’突出端。新形成的双链区域由于引物带有的切口酶识别位点从而为反应体系中的切口酶提供了作用位点。在切口酶与链取代扩增酶的双重作用下，上下游dna靶序列间的区域被指数倍扩增。具体的方法是，在引物结合后的反应体系中等体积加入链取代等温扩增反应酶类(终浓度：klenowfragmentexo-：0.1～0.5u/μl，nb.bbvci切口酶：0.01～0.2u/μl；dntps：100～300nm；ssb：500nm～2μm；bsa：0.1～0.3mg/μl；以及其它离子浓度，ph等如前述)，并在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育(60～120分钟)，即可完成扩增反应。在扩增的基础上，可进一步进行(四)检测反应。本步骤为通过传统的非变性page(非变性聚丙烯酰胺胶电泳)或实时荧光pcr仪等常规检测方法或试剂对扩增的产物进行定量检测。一种基于crispr-链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，试剂盒还包括了野生型cas9和/或核酸酶缺陷的cas9切口酶、特异性识别目标dna序列上下游的sgrna对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与cas9-sgrna复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，核酸酶缺陷的cas9切口酶为hnh核酸酶缺陷的cas9切口酶。野生型cas9和/或hnh核酸酶缺陷的cas9切口酶为typeiicrispr系统的效应蛋白，其来源包括但不限于酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)、齿垢密螺旋体(treponemadenticola)、新凶手弗朗西斯氏菌(francisellanovicida)、解纤维热酸菌(acidothermuscellulolyticus)。具体的野生型cas9和/或hnh核酸酶缺陷的cas9切口酶包括但不限于genbankaccessionid：wp_010922251、wp_059257345、wp_053019794、wp_014574210、wp_002684945、a0q5y3、abk53723。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，sgrna对的识别位点分别为目的序列上游ccn序列3’端的10～30个核苷酸序列和下游ngg序列5’端的10～30个核苷酸序列。特别的，sgrna对包含有一个5’端t7启动子，一个sgrna识别位点，以及一个80个核苷酸的crrna与trancrrna融合区域，方便通过t7rna聚合酶进行体外转录，并通过胶纯化和乙醇沉淀等手段获得提纯的sgrna。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，sgrna对识别位点的间距100～1000bp，优选100～250bp，识别位点5’端以ccn为起点，3’端靶序列以ngg为终点。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，链取代等温扩增试剂的dna引物具有如下特征：该引物5’端包含了一个切口酶识别位点，且该位点的酶切位点在其互补链上；该引物的中段与cas-sgrna复合体所识别的靶dna区域的ngg序列所在链的至少10个连续核苷酸互补配对。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，链取代等温扩增试剂的dna引物的3’端包含了一段1～10个核苷酸的与ngg序列所在链核苷酸互补的序列。作为上述等温扩增试剂盒的进一步改进，野生型cas9和/或hnh核酸酶缺陷的cas9切口酶，与合成的sgrna对按摩尔浓度1：2分别混合。优选地，cas9浓度为100nm，sgrna浓度为200nm。进一步的，cas9蛋白浓度，sgrna浓度，和引物浓度比为1:2:4，更优选地，其浓度分别为25nm，50nm，和200nm。更进一步的，反应缓冲液终浓度为：10-30mmtrishcl(ph8.0)、50-150mmkcl、1-5mmmgcl2、0.1％-1％(v/v)tween20。等温扩增酶类混合物各组分在10μl反应体系中的量为：0.1-0.5unb.bbvci，1-5uklenowfragment(exo-)，2-5mmdntps，2-5μm单链结合蛋白tp32，0.1mg/mlbsa。一种基于crispr-链取代的核酸检测试剂盒，包括上述的等温扩增试剂盒，以及核酸定量分析试剂。作为上述核酸检测试剂盒的进一步改进，核酸定量分析试剂选自特异性分子信标分子。基于crispr-链取代的等温扩增方法，包括如下步骤：1)获取待测样品核酸；2)使用上述等温扩增试剂盒含有的试剂对待测核酸样品进行扩增。基于crispr-链取代的等温扩增检测方法，包括如下步骤：1)获取待测样品核酸；2)使用上述等温扩增试剂盒含有的试剂对待测核酸样品进行扩增；3)对扩增产物进行分析，确定检测结果。样品可以是各种来源的样品，包括但不限于人体样品，如血液、唾液、呼吸道分泌物、尿液、泪液、汗液、毛发、皮肤拭子、口腔拭子、肿瘤组织、正常组织等；或者样品为动物样品，如动物组织、毛发、血液、分泌物等；或者样品为植物样品，如植物叶片、根茎、种子、花等；或者样品为环境样品，如地下水、地表水、海水、工业农业废水、土壤、空气等；或者样品来自于食品、饮用水、饲料等。样品中的核酸序列为rna时，可以进一步先进行反转录处理，之后再进行相应的扩增。扩增的反应产物的检测手段包括但不限于传统琼脂糖电泳、page电泳、毛细管电泳，或通过在反应体系中加入50-400μm的与待扩增检测区域特异性互补的分子信标分子并进行实时荧光检测。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本发明的保护范围。实施例1.利用本基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应对短目标dna双链进行特异性扩增，并通过传统page技术进行检测针对一段短dna双链(450bp)设计并通过体外转录合成了一对sgrna，分别特异性识别该短dna双链上游ccagtgcaagtgcaggtgccaga(seqidno：1)(其中5’端cca为pam序列ngg的互补序列)和下游ggcccagactgagcacgtgatgg(seqidno：2)(其中3’端tgg为pam序列)。识别上游和下游序列的sgrna被分别命名为sgrna-ups和sgrna-dns。sgrna-ups：gugcaagugcaggugccagaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：3)sgrna-dns：ggcccagacugagcacgugaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：4)以上述sgrna的结合位点所暴露的靶dna序列单链为结合位点的链取代等温扩增dna引物对被分别命名为ups-iso和dns-iso。ups-iso：tagatcggtaaggatagcgctgagggcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgat(seqidno：5)dns-iso：tagatcggtaaggatagcgctgaggacgtgctcagtctgggcctcgagc(seqidno：6)。待检测短dna双链母液浓度为223ng/μl，摩尔浓度为1μm。按1:10梯度稀释的方式，分步制备500nm～5am待检测短dna双链溶液。稀释溶液的离子浓度为50～300mm(nacl或kcl)，tween20浓度为0.1％～0.5％，bsa浓度为0.1～0.3mg/μl，ph范围为ph6～8.5。具体实验步骤如下：1)在一定的离子浓度(nacl或kcl，50～300mm)和ph范围(ph6～8.5)条件下，将识别上游dna靶序列的sgrna-ups和下游dna靶序列的sgrna-dns分别与野生型cas9和/或hnh核酸酶缺陷的cas9切口酶按摩尔浓度比为1：2在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育15分钟，以制备具有靶向活性的cas9-sgrna蛋白核酸复合体；在该步反应中，sgrna的浓度为20nm～400nm，野生型cas9和/或hnh核酸酶缺陷的cas9切口酶的浓度为10nm～200nm；2)将孵育后特异性识别上下游dna靶序列的cas9-sgrna蛋白核酸复合体按体积1：1混合；将1μl混匀后的cas9-sgrna蛋白核酸复合体加入10μl不同浓度(500nm～5am)的待检测短dna双链溶液中；在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育15分钟，以完成cas9-sgrna蛋白核酸复合体与待检测短dna双链中的上下游dna靶序列的识别反应；3)向识别完成后的反应体系中加入2μl一定浓度的上下游扩增引物(ups-iso和dns-iso浓度为分别为50nm～2μm)，在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育5分钟，以完成扩增引物与上下游dna靶序列区域被cas9-sgrna复合体结合后暴露出的单链区域的结合反应；4)等体积加入链取代等温扩增反应酶类(终浓度：klenowfragmentexo-：0.1～0.5u/μl，nb.bbvci切口酶：0.01～0.2u/μl；dntps：100～300nm；ssb：500nm～2μm；bsa：0.1～0.3mg/μl；以及其它离子浓度，ph等如前述)，并在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育(60～120分钟)，即可完成扩增反应；5)向扩增后的反应体系中按体积比20：1加入evagreen荧光染料，6：1加入36％的甘油水溶液，用6％的非变性page胶，在1xtbe，150v条件下电泳20分钟；电泳完成后的非变性page胶用荧光胶成像仪进行定量检测。实验结果显示(图2)，本发明的基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应可将低至50am的待检测短dna双链在1.5小时内扩增至可被传统非变性page检测到的水平(>5ng)，即大于108倍的扩增。为验证本发明的特异性，在通过在上述扩增反应中加入大于10ng/μl的非模板干扰dna后，其扩增结果未受任何影响。同时，由待检测短dna双链浓度为500fm但体系中无cas9蛋白的检测样品无任何可被检测的扩增条带，进一步验证了本扩增体系中cas9蛋白的作用。实施例2.利用本基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应对人基因组dna中的短目的片段进行特异性扩增，并通过传统page技术进行检测首先通过商业化试剂盒，从人胚肾细胞(hek293)中提取基因组dna。将提取的人基因组dna梯度稀释至2.5ng/μl。在该待检测样品中，人基因组dna的浓度约为692.4am。在检测中，使用质粒dna(pegfp-c2)或鼠基因组dna的溶液样品作为负对照。负对照中质粒dna(pegfp-c2)或鼠基因组dna的浓度均为30ng/μl。利用与实施例1相同的方法，针对人基因组中的特定区域，设计合成特异性识别该区域上下游靶dna序列的sgrna对。为验证本发明的基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应的可重复性，我们设计了3对sgrna对，针对人基因组中3个不同的位点开展了等温检测。待检测的3个位点分别为：位点1人第9号染色体：核苷酸序列110330835至110331009位点2人第9号染色体：核苷酸序列110331126至110331334位点3人第12号染色体：核苷酸序列13983991至13984189针对位点1的sgrna对，分别特异性识别该短dna双链上游cctaaggttgaggccagttgcaa(seqidno：7)(其中5’端cct为pam序列ngg的互补序列)和下游cttgtagctacgcctgtgatggg(seqidno：8)(其中3’端ggg为pam序列)。识别上游和下游序列的sgrna被分别命名为h-sgrna1-ups和h-sgrna1-dns。h-sgrna1-ups：aagguugaggccaguugcaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：9)h-sgrna1-dns：cuuguagcuacgccugugauguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：10)以上述sgrna的结合位点所暴露的靶dna序列单链为结合位点的链取代等温扩增dna引物对被分别命名为h1-ups-iso和h1-dns-iso。h1-ups-iso：tagatcggtaaggatagcgctgaggggttgaggccagttgcaaagacaattgacatgt(seqidno：11)h1-dns-iso：tagatcggtaaggatagcgctgaggcacaggcgtagctacaagattagttttgagac(seqidno：12)针对位点2的sgrna对，分别特异性识别该短dna双链上游ccttggagagttttaagcaaggg(seqidno：13)(其中5’端cct为pam序列ngg的互补序列)和下游ggcccagactgagcacgtgatgg(seqidno：14)(其中3’端tgg为pam序列)。识别上游和下游序列的sgrna被分别命名为h-sgrna2-ups和h-sgrna2-dns。h-sgrna2-ups：uggagaguuuuaagcaagggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：15)h-sgrna2-dns：ggcccagacugagcacgugaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：16)以上述sgrna的结合位点所暴露的靶dna序列单链为结合位点的链取代等温扩增dna引物对被分别命名为h2-ups-iso和h2-dns-iso。h2-ups-iso：tagatcggtaaggatagcgctgagggagagttttaagcaagggctgatgtgggctgc(seqidno：17)h2-dns-iso：tagatcggtaaggatagcgctgaggacgtgctcagtctgggccccaaggatt(seqidno：18)针对位点3的sgrna对，分别特异性识别该短dna双链上游ccacccggggtaccacggagaga(seqidno：19)(其中5’端cca为pam序列ngg的互补序列)和下游ggagaacagcactccgctctggg(seqidno：20)(其中3’端ggg为pam序列)。识别上游和下游序列的sgrna被分别命名为h-sgrna3-ups和h-sgrna3-dns。h-sgrna3-ups：ucucuccgugguaccccgggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：21)h-sgrna3-dns：ggagaacagcacuccgcucuguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(seqidno：22)以上述sgrna的结合位点所暴露的靶dna序列单链为结合位点的链取代等温扩增dna引物对被分别命名为h3-ups-iso和h3-dns-iso。h3-ups-iso：tagatcggtaaggatagcgctgaggcggggtaccacggagagatggtggaaatcat(seqidno：23)h3-dns-iso：tagatcggtaaggatagcgctgaggagcggagtgctgttctcccaagttctggttg(seqidno：24)。具体实验步骤如下：1.同实施例1中1～3步骤，在相同条件下，分别制备具有靶向活性的cas9-sgrna蛋白核酸复合体，完成cas9-sgrna蛋白核酸复合体与待检测短dna双链中的上下游dna靶序列的识别反应，和引物结合反应。2.等体积加入优化后的链取代等温扩增反应酶类(终浓度：klenowfragmentexo-：0.4～2u/μl，nb.bbvci切口酶：0.05～1u/μl；dntps：100～300nm；ssb：1μm～4μm；bsa：0.1～0.3mg/μl；以及其它离子浓度，ph等如前述)，并在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育(60～120分钟)，即可完成扩增反应。3.向扩增后的反应体系中按体积比20：1加入evagreen荧光染料，6：1加入36％的甘油水溶液，用6％的非变性page胶，在1xtbe，150v条件下电泳20分钟。电泳完成后的非变性page胶用荧光胶成像仪进行定量检测。实验结果显示(图3)，本发明的基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应可在低至670am～67am的人基因组样品中，于1.5小时内将目的片段特异性扩增至可被传统非变性page检测到的水平(>5ng)，即大于108倍的扩增。同时，在无cas9蛋白，或以质粒dna(pegfp-c2)或鼠基因组dna为干扰dna的样品中，未扩增出任何目的条带。实施例3.利用本基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应对短目标dna双链进行特异性扩增，并通过rt-pcr技术(实时荧光pcr)进行检测。利用与实施例1相同的方法，针对一段短dna双链(450bp)，使用实施例1中的sgrna对sgrna-ups和sgrna-dns对该短dna双链进行特异性扩增检测。具体实验步骤如下：1.同实施例1中1～3步骤，在相同条件下，分别制备具有靶向活性的cas9-sgrna蛋白核酸复合体，完成cas9-sgrna蛋白核酸复合体与待检测短dna双链中的上下游dna靶序列的识别反应，和引物结合反应。2.等体积加入优化后的链取代等温扩增反应酶类(终浓度：klenowfragmentexo-：0.4～2u/μl，nb.bbvci切口酶：0.05～1u/μl；dntps：100～300nm；ssb：1μm～4μm；bsa：0.1～0.3mg/μl；以及其它离子浓度，ph等如前述)，及针对待扩增区域设计的分子信标(mb：fam-ccgcgactgcctgcgtgagattctcgcacgcgg-dabcyl(seqidno：25)，100nm～400nm),并在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育(60～120分钟)，即可完成扩增反应。实验结果显示(图4)，本发明的基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应结合分子信标并利用实时荧光检测，可在1.5小时内检测低至1am的靶dna样品。实施例4.利用本基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应在高污染物背景下特异性检测人基因组中小片段dna，并通过传统page技术进行检测。利用与实施例2相同的方法，使用实施例2中的sgrna对h-sgrna2-ups和h-sgrna2-dns对针对人基因组中的特定区域进行特异性扩增检测。具体实验步骤如下：同实施例1中1步骤，在相同条件下，制备具有靶向活性的cas9-sgrna蛋白核酸复合体。1)在不同浓度的待检测短dna双链溶液中，1：1混入哺乳动物细胞超声粗裂产物(即100,000细胞/ml的pbs溶液充分超声破碎后的产物)。将孵育后特异性识别上下游dna靶序列的cas9-sgrna蛋白核酸复合体按体积1：1混合。将1μl混匀后的cas9-sgrna蛋白核酸复合体加入10μl不同浓度(500nm～5am)的待检测短dna双链溶液中。在特定温度下(室温～45℃，优选的37℃)孵育20分钟，以完成cas9-sgrna蛋白核酸复合体与待检测短dna双链中的上下游dna靶序列的识别反应。2)同实施例1中3～5步骤，完成引物与上下游dna靶序列区域被cas9-sgrna复合体结合后暴露出的单链区域的结合反应，引物结合反应，及最终的page检测。实验结果显示(图5)，大量的细胞破碎后的杂质(污染物)，对本发明的基于crispr-cas9系统的链取代扩增反应的效率及特异性无任何影响。sequencelisting<110>中国科学院深圳先进技术研究院<120>基于crispr-链取代的等温扩增及检测技术<130><160>25<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ccagtgcaagtgcaggtgccaga23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2ggcccagactgagcacgtgatgg23<210>3<211>97<212>rna<213>人工序列<400>3gugcaagugcaggugccagaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>4<211>97<212>rna<213>人工序列<400>4ggcccagacugagcacgugaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>5<211>59<212>dna<213>人工序列<400>5tagatcggtaaggatagcgctgagggcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgat59<210>6<211>49<212>dna<213>人工序列<400>6tagatcggtaaggatagcgctgaggacgtgctcagtctgggcctcgagc49<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7cctaaggttgaggccagttgcaa23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8cttgtagctacgcctgtgatggg23<210>9<211>97<212>rna<213>人工序列<400>9aagguugaggccaguugcaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>10<211>97<212>rna<213>人工序列<400>10cuuguagcuacgccugugauguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>11<211>58<212>dna<213>人工序列<400>11tagatcggtaaggatagcgctgaggggttgaggccagttgcaaagacaattgacatgt58<210>12<211>57<212>dna<213>人工序列<400>12tagatcggtaaggatagcgctgaggcacaggcgtagctacaagattagttttgagac57<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列<400>13ccttggagagttttaagcaaggg23<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列<400>14ggcccagactgagcacgtgatgg23<210>15<211>97<212>rna<213>人工序列<400>15uggagaguuuuaagcaagggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>16<211>97<212>rna<213>人工序列<400>16ggcccagacugagcacgugaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>17<211>57<212>dna<213>人工序列<400>17tagatcggtaaggatagcgctgagggagagttttaagcaagggctgatgtgggctgc57<210>18<211>52<212>dna<213>人工序列<400>18tagatcggtaaggatagcgctgaggacgtgctcagtctgggccccaaggatt52<210>19<211>23<212>dna<213>人工序列<400>19ccacccggggtaccacggagaga23<210>20<211>23<212>dna<213>人工序列<400>20ggagaacagcactccgctctggg23<210>21<211>97<212>rna<213>人工序列<400>21ucucuccgugguaccccgggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>22<211>97<212>rna<213>人工序列<400>22ggagaacagcacuccgcucuguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>23<211>56<212>dna<213>人工序列<400>23tagatcggtaaggatagcgctgaggcggggtaccacggagagatggtggaaatcat56<210>24<211>56<212>dna<213>人工序列<400>24tagatcggtaaggatagcgctgaggagcggagtgctgttctcccaagttctggttg56<210>25<211>33<212>dna<213>人工序列<400>25ccgcgactgcctgcgtgagattctcgcacgcgg33当前第1页12