本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于巢式pcr检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物及应用。
背景技术：
随着核桃集约栽培程度的不断提高和种植面积扩大，传统的粗放管理模式及不适宜品种的选择导致核桃病害危害日趋严重，已成为核桃产业发展面临的严峻问题，其中炭疽病是近年来危害核桃产业的主要病害，在核桃上主要危害果实，引起早期落果或核桃不成实，发病重的年份可致丰产不丰收，而且感染叶片、嫩梢，病害连片，造成叶片、嫩梢大面积坏死。核桃炭疽病的病原菌为胶胞炭疽菌(colletotrichumgloeosporioidespenz.)，属半知菌亚门、腔孢纲、炭疽菌属。该病原菌在病枝、病果或土壤中越冬，翌年春季病原菌开始活动并借风、雨、昆虫传播。发病轻重与降雨密切相关，雨季早且降雨量大则病害发病早且严重，此外，水位高、株行间距小、通风透光不良也易造成病害发病严重和传播蔓延。由于该病具有潜伏侵染的特性，且具有发病时间集中、爆发性强等特点，故选择化学药剂进行防治仍是当前主要对策，但发病后再进行防治，往往对核桃产量已造成较重影响。因此亟需一种能够在发病初期进行早期快速检测的技术，为及时有效的防控措施提供指导。
传统的植物病害的诊断主要依据植株的明显病症和病原菌形态，操作难度大，耗时耗力，且此时病害往往已对植株造成危害，因此亟需快速而准确的检测技术应用于植物病害的诊断过程中。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速而准确的检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的手段。
本发明的技术方案为：用于巢式pcr检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物，它由第一轮引物对和第二轮引物对构成，其中，第一轮引物对的上游引物序列如seqidno.1所示，第一轮引物对的下游引物序列如seqidno.2所示，第二轮引物对的上游引物序列如seqidno.3所示，第二轮引物对的下游引物序列如seqidno.4所示。
上述所述的特异性引物在巢式pcr检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌上的应用。
一种巢式pcr试剂盒，含上述所述的特异性引物。
一种检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的方法，包括如下步骤：
(1)采取待测的样品，并提取总dna；
(2)以总dna为模板使用seqidno.1和seqidno.2的引物对进行第一轮pcr扩增；
(3)取第一轮pcr扩增产物为模板使用seqidno.3和seqidno.4的引物对进行第二轮pcr扩增；
(4)结果判断：检测第二轮pcr扩增产物，结果出现302bp特征条带说明所述样品具有了核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌；未出现302bp特征条带说明所述样品未具有核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌。
进一步地，上述所述的方法中，所述第一轮pcr扩增体系如下：扩增体系：taqdna聚合酶12.5ul，seqidno.1、seqidno.2所示引物各1ul，dna模板1ul，双蒸水9.5ul，总体积25ul；pcr扩增条件如下：94℃变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火55s，72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min，终止温度为4℃；所述第二轮pcr扩增体系如下：扩增体系：taqdna聚合酶12.5ul，seqidno.3、seqidno.4所示引物各1ul，第一轮pcr扩增产物1ul，双蒸水9.5ul，总体积25ul；pcr扩增条件如下：94℃变性5min；然后94℃变性1min，69℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min，终止温度为4℃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法具有操作简便，灵敏度高，特异性强，检测速度快等特点，可被广泛应用于核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的检测，本方法针对核桃炭疽病致病菌进行检测，提供了该致病菌快速、高灵敏度的检测方法和体系。本发明检测方法与传统的核桃炭疽病病害的诊断方法以及常规pcr相比，具有准确性高，特异性、灵敏度和重复性好等特点。本发明检测时间只要6小时左右，每检测一个样品只需要一个叶片，只需一个人就可以完成对多个地区的样品检测；而传统的核桃炭疽病病害的诊断方法耗时耗力，预警性差，常规pcr检测虽然检测时间短，但灵敏度、准确性较巢式pcr差。
附图说明
图1为四川农业大学林学院森林保护病理实验室从四川、陕西、湖北等地采集的疑似患有炭疽病的核桃枝叶组织以及患有核桃其他病害(非炭疽病)的核桃枝叶组织特异性检测结果电泳图；泳道m为dl2000dnamarker；泳道1-8为疑似患有炭疽病的核桃枝叶组织；泳道9-23为患有核桃其他病害(非炭疽病)的核桃枝叶组织；泳道n：阴性对照；
图2为采集于四川农业大学崇州基地的有典型炭疽病病症核桃枝叶组织和发病初期无明显病症的核桃枝叶组织检测结果电泳图，健康核桃枝叶组织为阴性对照；泳道m为dl2000dnamarker；泳道1为具有典型炭疽病病症核桃枝叶组织；泳道2为发病初期无明显病症的核桃枝叶组织；泳道3为健康核桃枝叶组织。
具体实施方式
下面通过具体实施方式详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常用生化试剂商店够买所得，特异性引物委托成都擎科生物技术有限公司合成。
生物材料来源
表1生物材料获取来源：
以下材料采集自四川农业大学崇州基地：
人工接种有典型炭疽病病症核桃枝叶组织
人工接种发病初期无明显病症的核桃枝叶组织
健康核桃枝叶组织
实施例1用于核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌的特异性引物序列设计
步骤一、序列获得
1、通过ncbi的genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索所有已报道、已发现、已提交数据库的炭疽属不同种的its序列；
2、将尽可能多的炭疽属不同种的its序列下载后，使用dnaman软件进行序列比对分析；
3、通过dnaman软件进行多重同源性比较，根据比对结果选取序列差异位点；
步骤二、方法：使用primer6，oligo引物设计软件根据差异位点设计引物。
步骤三、引物设计原则：
1、两引物中g+c碱基对的百分比尽量相似；
2、引物内部避免具有明显的二级结构；
3、两引物之间不应有互补序列，避免形成“引物二聚体”；
4、引物与靶dna片段的配对须精确、严格，尤其3’末端；
5、特异引物应具有一定的退火温度(不低于50℃)和一定的长度(不少于18个bp)。
步骤四、结果：
在ncbigenbankdatabase(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)内使用blastn初步验证引物的特异性。
本发明获得的引物对序列如下：
第一轮引物对：
上游引物its1:5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(seqidno.1)；
下游引物its4:5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(seqidno.2)；
第二轮引物对：
上游引物yh1:5’-tcccgcctccgggcgggtcg-3’(seqidno.3)；
下游引物yh2:5’-tttgagggcctacatcagc-3’(seqidno.4)。
该引物扩增的条带清晰，扩增结果稳定，重复性好。
实施例2验证pcr引物在检测核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌中的有效性和特异性
步骤1.获取待分析区域的疑似被侵染样品
本实施例中疑似感染样品包括：具有炭疽病病症核桃枝叶组织，病症特点为叶片、果实具有近圆形或不规则的黑褐色病斑，其上多具有同心轮纹状排列的黑色小点等。
采取到疑似被侵染样品后，立即进入步骤3或-80℃保存。
步骤2合成本发明设计的如下引物
第一轮引物对：
上游引物its1:5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(seqidno.1)；
下游引物its4:5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(seqidno.2)；
第二轮引物对：
上游引物yh1:5’-tcccgcctccgggcgggtcg-3’(seqidno.3)；
下游引物yh2:5’-tttgagggcctacatcagc-3’(seqidno.4)。
步骤3.植物样品总dna提取
植物基因组dna提取试剂盒
1.取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨。
2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul65℃预热缓冲液gp1的离心管中(实验前在预热的gp1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3.加入700ul氯仿，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min。
4.小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700ul缓冲液gp2，充分混匀。
5.将混匀的液体转入吸附柱cb3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃掉废液。(吸附柱容积为700ul左右，可分次加入离心。)
6.向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
7.向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
8.重复操作步骤7.
9.将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、pcr等)实验。
10.将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50ul，体积过小影响回收效率。洗脱液的ph值对于洗脱效率有很大影响。若用ddh2o做洗脱液应保证其ph值在7.0-8.5范围内，ph值低于7.0会降低洗脱效率；且dna产物应保存在-20℃，以防dna降解。为增加基因组dna的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
提取的dna先用1.0％琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用dna/rnananodrop测定浓度。dna提取物于-20℃存储备用。
步骤4.特异性pcr产物扩增
第一轮pcr扩增体系如下：扩增体系：taqdna聚合酶12.5ul，seqidno.1、seqidno.2所示的引物各1ul，dna模板1ul，双蒸水9.5ul，总体积25ul；pcr扩增条件如下：94℃变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火55s，72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。
第二轮pcr扩增体系如下：扩增体系：taqdna聚合酶12.5ul，seqidno.3、seqidno.4所示的引物各1ul，第一轮pcr扩增产物1ul，双蒸水9.5ul，总体积25ul；pcr扩增条件如下：94℃变性5min；然后94℃变性1min，69℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min，终止温度为4℃。
步骤5.电泳检测
取步骤(4)扩增产物8.0ul，点样于1.0％的琼脂糖凝胶，于琼脂糖凝缓冲液中、110v/cm电压下电泳25min，电泳结束后于自动凝胶成像系统上照相。
按照步骤1～5，分别对不同地区不同部位的疑似患有炭疽病的核桃枝叶组织以及患有核桃其他病害(非炭疽病)的核桃枝叶组织进行检测；
图1编号1-8为疑似患有炭疽病的核桃枝叶组织，编号9-23为患有核桃其他病害(非炭疽病)的核桃枝叶组织，编号n为阴性对照，编号m为dl2000dnamarker；
电泳结果见图1，编号1-8均扩增出分子量为302bp的特征dna条带，编号9-23以及编号n均未扩增出特征dna条带。
步骤6.回收pcr产物
编号1-8回收的pcr产物连接到t载体后，送公司测序。序列分析结果显示，扩增的片段为302bp，序列为核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌序列。
实施例3核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌早期检测验证
材料：
人工接种有典型炭疽病病症核桃枝叶组织
人工接种发病初期无明显病症的核桃枝叶组织
健康核桃枝叶组织
以上材料采集自四川农业大学林学院森林保护病理实验室
方法步骤
检测步骤同是实施例2的操作。
检测结果，检测结果如图2所示，本发明的方法能够在核桃炭疽病发病初期病症不明显的时候就检测出核桃炭疽病致病菌胶胞炭疽菌，可快速准确的对核桃炭疽病病原菌胶胞炭疽菌进行分子鉴定和早期诊断。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110>四川农业大学
<120>巢式pcr快速检测胶胞炭疽菌的体系建立及应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tccgtaggtgaacctgcgg19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tcctccgcttattgatatgc20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcccgcctccgggcgggtcg20
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tttgagggcctacatcagc19