本发明属于干细胞再生生物领域，具体涉及多能干细胞再生类视网膜器官，获取视网膜种子细胞的方法。
背景技术：
视网膜退行性疾病是导致不可逆性失明的主要眼病，主要由于光感受器细胞、rpe细胞或神经节细胞遭受不可逆损伤。然而，该类疾病目前尚无有效治疗方法。干细胞治疗为该类疾病带来了新的复明希望，获得与人视网膜细胞特性类似的，且数量充足的种子细胞，是视网膜退行性疾病复明治疗及疾病机制研究的关键。人视网膜细胞以往多从流产的胚胎视网膜中分离获得，但数量非常有限，批次质量等难以控制，无法满足临床治疗的需要,限制了视网膜细胞治疗技术的发展。近年来，人视网膜细胞也可以从人多能干细胞(humanpluripotentstemcell,hpsc)包括胚胎干细胞(esc)及诱导多能干细胞(ipsc)定向诱导分化而来，为视网膜种子细胞提供了新的来源。目前，已有多种诱导分化方案指导hpsc逐步向视网膜细胞分化。第一，在经典贴壁(即二维，2d)培养条件下，hpsc不仅分化出了多种视网膜细胞，包括神经节细胞，rpe细胞以及光感受器细胞等，还可直接诱导出原始视泡样结构，后者进一步分化出多种视网膜细胞；第二，随着3d悬浮组织诱导培养体系的发展，3d视网膜诱导培养方法诞生。日本科学家利用悬浮ebs的方法，分别从小鼠和人的esc分化获得了3d视泡，后者进一步分化出各种发育中的视网膜细胞；第三，我国科学家钟秀风教授采用2d与3d结合的诱导培养条件，开发了一套视网膜诱导分化体系，先将hipscs悬浮培养，获得拟胚体ebs，再将ebs重新贴壁分化，获得了具有分层结构的3d类视网膜组织，包括所有主要视网膜细胞，长期培养后可以获得具有功能的光感受器细胞。尽管多能干细胞诱导视网膜的技术取得长足进步，但目前视网膜诱导分化方案也存在一些不足。第一，多数诱导方案较复杂，需要添加各种细胞因子或信号分子，包括视黄酸a(retinoicacid,ra)；第二，所获的视网膜光感受器细胞以视杆细胞为主，视锥细胞很少。视锥细胞负责强光视觉或明视觉、色彩和精锐视觉，集中在视网膜的黄斑区域。视杆细胞负责夜视觉或暗视觉，分布在视网膜的周边部。人类主要在白天活动，因此，主要依赖于视锥细胞的功能。年龄相关视网膜黄斑病变已成为全球50岁以上人群的主要致盲眼病，主要由视锥细胞变性死亡所致。因此，当前的视网膜诱导方案难以满足临床治疗所需。技术实现要素：针对现有视网膜诱导分化技术存在的问题(成分复杂，难以获得视网膜疾病治疗所需要的视锥细胞)，本发明提供了一种改良的、简单、高效获取富含视杆及视锥细胞的类视网膜的诱导方案。本发明的利用人诱导多能干细胞获得富含视锥及视杆细胞的类视网膜组织的方法，包括将hipscs克隆消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀悬浮培养得到拟胚体；拟胚体再接种至预先用matrigel包被的培养皿中，在诱导培养液中诱导分化，获得神经视网膜(neuralretina,nr)和rpe；将nr和rpe再挑起，悬浮培养，获得3d类视网膜包括nr组织和rpe。使用不含ra的培养液中长期悬浮培养，nr不仅可以发育出所有视网膜细胞，包括高度成熟的光感受器细胞，rhodopsin阳性视杆细胞，l/mopsin阳性红绿锥细胞和s-opsin阳性蓝锥细胞，特别是获得了富含视杆和红绿视锥细胞的nr或类视网膜组织。本发明的第一个目的提供了一种消化hipscs克隆的方法，其特征在于优选，所述的将hipscs克隆消化得到细胞沉淀是将hipscs克隆用edta消化得到细胞沉淀。与dispase消化相比，edta消化具有如下优点：1)用edta消化的hipscs克隆可以轻轻吹打分散成小片,而用dispase消化后的产物多为小团块，以致于对后期ebs形成的大小以及均一性造成影响；2)同时用edta和dispase消化相同数量的hipscs细胞，edta消化后获得的ebs数量远远大于dispase消化获得的ebs量；3)edta是化学试剂，非动物源来源，便于临床转化应用；而dispase是蛋白酶，批次间有差异，为动物源来源，不利于临床转化应用；4)edta消化时间短，在37度消化温度下，约3-6min，活性稳定可控；而dispase消化时间长，活性不稳定，在37度消化温度下，需要10-20min，不好掌握条件，重复性差。优选，所述的用edta消化是用0.5μmedta，37℃消化5min。本发明的第二个目的是提供了一种高效简单的从hipscs诱导分化出富含大量视锥细胞和视杆细胞的3d视网膜的方法，其包括获得3d视网膜组织，然后将3d视网膜组织在培养液中进行培养，其特征在于，是将3d视网膜组织在不含有视黄酸的优化培养液中进行培养。长期培养后的3d视网膜组织发育出成熟的光感受器细胞，约有43％的3d类视网膜组织富含l/mopsin阳性红绿视锥细胞，远高于先前的研究报道。将消化后的hipscs细胞，通过加入10mmblebbistatin进行悬浮培养，生成拟胚体(ebs)，再接种至预先用matrigel包被的培养皿中，用培养液进行视网膜诱导分化，分化出的视网膜和rpe用tungsten针挑起进行悬浮培养，长期培养后获得层次清晰，富含成熟光感受器细胞的3d视网膜组织。按照诱导分化过程依次用的培养基为mtesr1、nim培养液、rdm培养液、rc2培养液、rc1培养液，mtesr1为hipscs维持培养液，nim培养液为早期神经诱导培养液，rdm培养液为视网膜诱导培养液，rc2培养液和rc1培养液为3d视网膜组织培养液。所述的rc2培养液和rc1培养液为不添加视黄酸的rc2/ra培养液、rc1/ra培养液。不添加视黄酸一方面减少了外源分子的诱导影响，另一方面节约了培养基的成本(隔天加ra换新的培养液损失大量培养液)。另外，视黄酸是视网膜光感受器发育分化的重要信号分子，以前的研究表明，高浓度的ra抑制了视锥细胞的发育成熟。本发明中不添加视黄酸的培养基促进了光感受器细胞的发育成熟，特别是诱导出了更多的红绿视锥细胞，有望为人视网膜黄斑病变的细胞治疗提供所需要的种子细胞。所述的3d视网膜组织在不含有ra的培养液中进行培养是将3d视网膜组织先后在rc2培养液和rc1培养液中培养，所述的rc2培养液和rc1培养液分别指的是不含ra(视黄酸)的rc2/ra培养液、rc1/ra培养液。本发明的有益效果如下：用edta消化hipscs来启动分化并制备eb的优势如下：1)用edta消化的hipscs克隆可以轻轻吹打分散成小片,而用dispase消化后的产物多为小团块，以致于对后期ebs形成的大小以及均一性造成影响；2)同时用edta和dispase消化相同数量的hipscs细胞，edta消化后获得的ebs数量远远大于dispase消化获得的ebs量；3)edta是化学试剂，非动物源来源，便于临床转化应用；而dispase是蛋白酶，批次间有差异，为动物源来源，不利于临床转化应用；4)edta消化时间短，在37度消化温度下，约3-6min，活性稳定可控；而dispase消化时间长，活性不稳定，在37度消化温度下，需要10-20min，不好掌握条件，重复性差。ra是一种脂溶性的小分子，是维生素a(vitamina)的代谢产物，在胚胎发育过程中具有重要的意义。在眼发育过程中，ra对视原基形成，细胞增殖和分化具有重要作用。除此之外，体内和体外研究都发现ra对光感受器细胞的发育有重要的调节作用。基于上述理论，为促进光感受器细胞的发育成熟，用esc或ipscs向光感受器分化的诱导方案，培养基都或多或少的加入了ra做为诱导剂，其结果是在这些系统中诱导出的的光感受器细胞以视杆细胞为主，视锥细胞很少。本发明的3d视网膜分化系统巧妙地解决了该问题，不仅获得了富含视杆细胞的类视网膜组织，还首次获得了富含红绿视锥细胞的视网膜组织。与其它诱导分化方案相比，本发明的新方案在视网膜组织长期培养过程中，不添加小分子诱导剂ra，在该系统的培养过程中，3d视网膜仍旧发育良好，保持分层结构，早期发育出主要的神经节细胞和中间神经元，在后期发育出成熟的光感受器细胞，并有约一半的3d视网膜组织富含红绿视锥细胞。创新性地提出新观点，ra在体外视网膜光感受器细胞发育成熟过程中，不是必须添加成分，在缺乏ra的诱导环境中，3d视网膜发育出富含红绿视锥细胞的组织。该发明的优势是1)获得大量富含视锥细胞的视网膜组织；2)减少外源成分ra加入，促进诱导系统的临床转化应用；3)节约培养基成本和劳力成本，减少了污染风险。以往研究中，由于ra极其不稳定，需要频繁(有的每天)补充和更换培养液，损失了大量培养液,需要大量人力维持细胞，并增加了细胞污染的风险。附图说明：图1是edta与dispase对hipscs的消化初期及eb总量对比图：图a等同量的hipscs分别用edta(左图)和dispase(右图)消化后获得相似的量的细胞沉淀；图b分别用edta(左图)和dispase(右图)消化后的hipscs进行eb制备，第六天eb离心后，edta消化的hipscs获得的eb沉淀(左图)比edta消化的hipscs获得的eb沉淀(右图)大。图2是对比edta与dispase消化处理对eb形成的影响图：图a，图b和图c分别是用edta消化后d0,d3和d6的eb形态和数量；图d，图e和图f分别是用dispase消化后d0,d3和d6的eb形态和数量，edta消化所得eb形态相对较均一，而且数量较多。图3是无ra优化诱导系统不影响3d视网膜早期和中期分化：图a和图b显示3d视网膜(w6)早期表达视网膜前体细胞标志物pax6和vsx2,图c显示早期3d视网膜(w6)发育出brn3阳性的神经节细胞，图d显示中期3d视网膜(w13)发育出ap2阳性的无长突细胞。图4是无ra优化诱导培养系统长期培养的类视网膜组织(分化后34周)。图a是低倍图；图b是图a的局部放大图，显示毛刷状的外节。图5是免疫荧光显示无ra系统培养的部分类视网膜组织富含rhodopsin阳性视杆细胞(w21)。图6是免疫荧光显示无ra系统培养的部分类视网膜组织富含红/绿视锥细胞：图a免疫组化结果显示3d视网膜组织富含大量l/mopsin阳性的红绿视锥细胞，图b为图a白色方框的放大图，图c显示图a同一类视网膜组织中rhodopsin阳性的视杆细胞减少，图d为图c白色方框的放大图。图7是免疫荧光显示无ra优化系统培养的类视网膜组织含有少量s-opsin阳性的蓝色视锥细胞(w21)。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：一、hipscs的维持培养1、hipscs细胞：尿液来源的人类诱导多能干细胞，细胞系ue0172、试剂及耗材：1)mtesr1培养基：stemcell,#05851，4℃2)edta：invitrogen，15575-038，常温3)dispase，sigma，d4693，常温4)pbs(1x)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202，常温5)matrigel：corning，354277，-20℃6)六孔板：falcon，3530467)离心管：bdfalcon，3520963、仪器1)co2培养箱：sanyo，mco-20a1c2)倒置显微镜：nikon，ts1004、步骤：hipscs维持培养于mtesr1培养基中，待密度长至约80％-90％底面积时进行传代(约4-5天)，用0.5mm的edta或1mg/ml的dispase进行消化，消化后的细胞种于matrigel包被的培养板上。二、hipscs的消化方式对拟胚体(ebs)形成的影响1、细胞：步骤一培养的hipscs细胞2、试剂及耗材：1)mtesr1培养基：stemcell，#05851，4℃2)nim培养基(配方见表1，其配制方法是将各成分按其含量混合均匀即可)3)edta：0.5medta溶液，invitrogen，15575-038，常温4)dispase，sigma，d4693，常温5)blebbistatin：sigma6)matrigel：corning，354277，-20℃7)低吸附皿(100mm)：3、仪器：1)co2培养箱：sanyo，mco-20a1c4、步骤：用edta消化hipscs制备eb：在光学显微镜下将步骤一的hipscs克隆中已分化的细胞刮除，剩余的吸去培养液，用无菌pbs清洗一遍，加入0.5mmedta，37℃孵育5min，用枪头轻轻吹打3-5次左右，收集细胞悬液，1000rpm，离心4min，细胞沉淀用含有10μm的blebbistatin的培养液重悬，37℃悬浮培养，过夜。用dispase消化hipscs制备eb：先在光学显微镜下将步骤一的hipscs中已分化的细胞刮除，剩余的吸去培养液，用无菌pbs清洗一遍，加入1mg/ml的dispase，37℃孵育15min，用枪头轻轻吹打5次左右，收集细胞悬液，1000rpm，离心4min，细胞沉淀用含有10μm的blebbistatin的培养液重悬，37℃悬浮培养，过夜。将edta或dispase消化的细胞沉淀分别重悬于含有10μm的blebbistatin的培养液中，转移到低吸附皿，37℃培养过夜，ebs制备当天标记为第0天，次日记为第1天，第1天，培养液替换为体积分数25％nim(配方见表1)+体积分数75％mtesr1；第2天，培养液替换为体积分数50％nim+体积分数50％mtesr1，从第三天开始全部换成nim培养液培养，连续悬浮培养至第6-7天。第二天可见ebs形成，连续保持悬浮培养6-7天，分别离心，观察沉淀大小(图1)。如图1所示，相同数量的hipscs分别用edta或dispase消化，图1-a显示用两种方法消化后的细胞沉淀基本一致；图1-b显示，悬浮6天后的eb沉淀，edta消化获得的ebs量明显高于dispse消化。图2是对比edta与dispase消化处理对eb形成的影响，如图2所示，相同数量的hipscs分别用edta或dispase消化，图2-a和图2-d分别显示edta和dispase消化当天的细胞团块大小和数量，edta消化后的细胞较分散均一，而dispase的消化产物有些呈小片状，当天观察细胞数量未有明显差异；图2-b和图2-e分别为聚集3天后的ebs，edta消化获得ebs数量明显多于dispase；图2-c和图2-f分别为6天后的ebs，edta消化获得ebs数量明显多于dispase。三、3d视网膜分化及无ra配方诱导光感受器成熟1、细胞：hipscs(ue017)2、试剂及耗材：1)rdm培养液：配方见表2，其配制方法是将各成分按其含量混合均匀即可；2)rc2培养液：配方见表3，其配制方法是将各成分按其含量混合均匀即可；3)rc1-培养液：配方见表4，其配制方法是将各成分按其含量混合均匀即可；4)低吸附24孔板或低吸附皿：biofil，170313-0763、仪器：1)co2培养箱：sanyo，mco-20a1c4、步骤：用上述edta方案消化hipscs，并悬浮培养获得ebs。消化当天标记为第0天(d0)，次日记为第1天，以此类推。第6或7天，将ebs重新接种在预先用matrigel包被的培养皿中，开始贴壁培养诱导分化。分化第四周，nr和rpe区域初步形成，倒置显微镜下可以辨认，并用钨丝中挑起，移入到低吸附的24孔板或低吸附皿内悬浮培养，每周换液2-3次。悬浮培养条件下，nr发育增厚，逐渐形成半透明的环状，一端附带或多或少的rpe，称为“3d类视网膜组织”，并可以长期培养，nr继续分化，发育分化出所有视网膜神经元细胞，包括光感受器细胞。培养液方案与已发表文章类似(参考文献xiufengzhong,naturecommunications2014)，除了未添加任何ra，具体为：第6-15天，采用nim(表1)进行神经诱导，第16-41天用rdm培养液(表2)，从第42-90天，3d视网膜用加入fbs的rc2培养液(表3)进行培养，从第91天开始用rc1培养液(表4)进行更长期培养。ra通常被认为具有调控视网膜发育及光感受器细胞成熟的作用，原方案(现有技术中的方案,表5rc2/ra培养液和表6rc1/ra培养液，参考文献xiufengzhong，naturecommunications2014)中添加ra进行诱导，从第42-90天或第63-90天，用含有1μmra的rc2培养液每天或隔天换液(表5，其配制方法是将各成分按其含量混合均匀即可)，从91天以上，隔天换含有0.5μmra的rc1培养液(表6，其配制方法是将各成分按其含量混合均匀即可)，诱导3d视网膜分化和光感受器成熟。而在本发明中，3d视网膜组织依旧选择在上述两个时间点分别用rc2和rc1培养液培养，但不加入ra诱导，具体培养液的配方如表3和表4所示。每批选取早期3-5个3d视网膜组织，固定，脱水，切片，进行免疫荧光染色鉴定。结果说明，在无ra的诱导系统中3d视网膜发育未受到影响，并同样遵循视网膜的发育历程。从图3中可以看出，本发明的方案中，hipscs同样遵循视网膜的发育历程，悬浮初期的3d视网膜表达早期神经视网膜标志物pax6和vsx2(图3-a和3-b)，发育中期生成brn3阳性的神经节细胞(图3-c)，以及ap2阳性的无长突细胞(图3-d)。经过长达17周以上(最长34周)的培养，3d视网膜组织分化出成熟的光感受器细胞。图4中可以看出，图4-a为在rc2和rc1培养基中，进行长期培养的3d视网膜，约为34w视网膜；图4-b显示该视网膜组织含有大量外节结构。长期培养的3d视网膜组织，每批选取3-5个，固定，脱水，切片，进行免疫荧光染色鉴定(通用技术)。结果发现，本发明分化系统产生的视网膜组织中约50％的3d视网膜组织以rhodopsin阳性的视杆细胞为主(7/14,n＝14)，图5显示在无ra添加的优化培养环境中，3d视网膜含有大量rhodopsin阳性的视杆细胞。更重要的是，约有43％的3d视网膜组织含有大量的l/mopsin阳性的红绿视锥细胞(6/14,n＝14)，图6-a为无ra添加环境中，3d视网膜含有大量l/mopsin阳性的视锥细胞，图6-b为左侧白色方框中的放大图，图6-c显示该组织中rhodopsin阳性的视杆细胞比例减少，图6-d为左侧白色方框中的放大图。图7显示在无ra添加的培养环境中，3d视网膜含少量sopsin阳性的蓝视锥细胞。而现有技术系统获得的3d视网膜组织，90％以上为rhodopsin阳性视杆细胞，少量l/mopsin阳性的红绿视锥细胞和少量s-opsin阳性的蓝锥细胞。因此，与现有技术相比，本发明系统可以获得更多的含有l/mopsin阳性的红绿视锥细胞的视网膜组织，而s-opsin阳性的蓝视锥细胞比例仍较小，与之前的研究基本一致。表1nim培养液(第3-15天)ingredientamount(ml)finalconcentrationdmem/f12(1:1)(gibco,c11330500bt)500.00100×n2(gibco,17502-048)5.001xheparin(2mg/mlinpbs,)0.502ug/ml100×mem-neaa(gibco,11140-050)5.001x510.50表2rdm培养液(第16-41天)表3rc2培养液(第42-90天)(本发明)ingredientamount(ml)finalconcentrationdmem/f12(1:1)(gibco,c11330500bt)250.00dmembasic(gibco,c11995500bt)175.0050×b27withoutvitamina(gibco,12587-010)10.001x100×antibioticandantimycotic(gibco,15240)5.001x100×mem-neaa(gibco,11140-050)5.001xfbs(gibco,10099-141)50.0010％100×glutamax(gibco,35050-061)5.001×1000×taurine(sigma,#t-0625)0.50100μm500.50表4rc1培养液(第91天后)(本发明)ingredientamount(ml)finalconcentrationdmem/f12-glutamax(gibco,c10565-018)450.00100×n2supplement(invitrogen,17502-048)5.001x100×antibioticandantimycotic(gibco,15240)5.001x100×mem-neaa(gibco,11140-050)5.001xfbs(gibco,10099-141)50.0010％1000×taurine(sigma,#t-0625)0.50100μm515.50表5rc2/ra培养液(第42-90天)(旧方案)表6rc1/ra培养液(第91天后)(旧方案)当前第1页12