本发明涉及食品检测技术领域，更具体地说，它涉及一种大肠菌群的检测方法。
背景技术
在食品行业，大肠菌群的含量是一项重要的卫生指标。对于大肠菌群的检测方法有传统国家标准方法(gb)采用9管发酵、荧光方法(sn)、显色培养基方法、膜过滤方法等。在检测大肠菌群钱，首先要对检测样品进行菌体分离富集、去除干扰物。
在一些类于夫妻肺片，其含有较多植物油、动物油等油性物质的食品检测大肠菌落时，这些油性物质影响对菌体的分离收集，需要将油性物质去除。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种大肠菌群的检测方法，其具有去除油性物质后对菌体进行分离富集的作用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种大肠菌群的检测方法，包括如下步骤：
s1、在无菌台内取25g样品，剪碎；
s2、将样品在5-10倍无菌盐水中进行均质处理，得到悬浮液；
s3、将s2中的悬浮液在离心机中以1000-1500r/s的速度离心4min；
s4、轻轻吸取表层油状液体，并弃之；
s5、均质s4中的剩余物质，加入助滤剂，并将其以真空过滤法滤过28～32μm的一级滤膜；
s6、取s5中的滤后液过0.2～0.45μm的二级滤膜；
s7、用无菌生理盐水多次洗涤二级滤膜，大肠菌体截留在二级滤膜上；
s8、收集二级滤膜上的大肠菌体，进行大肠菌群检测。
通过采用上述技术方案，通过将样品剪碎，并用无菌盐水稀释，进行均质，样品中的大肠菌群充分分散，得到悬浮液；将悬浮液低速离心，使得油性物质上浮于表面，且低速离心不影响大肠菌群的活性，利用移液枪吸取表层油状液体并弃之，防止油状物质对后续实验产生影响，吸取要轻防止下层大肠菌群上浮；均匀去除油性物质后剩余的物质，并加入助滤剂，能够促进过滤、去除色素；通过一级过滤，去除大颗粒渣粒，通过二级过滤，去除干扰物去除小分子干扰物质，达到菌体分离富集，随后收集菌体，并进行菌体检测即可。
进一步的，s8中的大肠菌群检测采用mpn法进行检测，具体检测步骤如下：
s8-1、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)，每管接种1ml，36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，未产气者为大肠菌群阴性，大肠菌群阴性；
s8-2、用接种环从产气的lst肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
通过采用上述技术方案，通过mpn法可检测出大肠菌群的含量。
进一步的，s5中的一级滤膜的材质为聚丙烯、聚氯乙烯、纤维素酯类、聚碳酸酯类、聚四氟乙烯中的任一种，所述一级滤膜的孔径为30μm。
通过采用上述技术方案，30μm孔径的一级滤膜可有效过滤大颗粒残渣。
进一步的，s6中的二级滤膜为材质为聚丙烯、聚氯乙烯、纤维素酯类、聚碳酸酯类、聚四氟乙烯中的任一种，所述二级滤膜的孔径为0.3～0.4μm。
通过采用上述技术方案，0.3～0.4μm孔径的二级滤膜可有效截留大肠菌群，去除小分子干扰。
进一步的，s7中洗涤次数为2-3次，每次洗涤用无菌生理盐水的量为20-50ml。
通过采用上述技术方案，用生理盐水多次洗涤，将二级滤膜上的小分子杂质充分洗刷干净。
进一步的，所述助滤剂为吐温-60或吐温-80，所述助滤剂占稀释溶液的重量百分比为千分之0.5～千分之2。
通过采用上述技术方案，为防止滤渣堆积过于密实，使过滤顺利进行，而使用细碎程度不同的不溶性惰性材料增加过滤速率，吐温-60和吐温-80均为良好的助滤剂。
进一步的，s8-1中所述月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，胰蛋白胨20g，氯化钠5.0g，乳糖5.0g，磷酸氢二钾2.75g，磷酸二氢钾2.75g，月桂基硫酸钠0.1g。
通过采用上述技术方案，胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂；月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群细菌的生长。
进一步的，所述月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)的ph值为6.8±0.2。
通过采用上述技术方案，该ph范围适宜大肠菌群生长。
进一步的，s8-2中所述煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，蛋白胨10g，乳糖10g，牛胆粉20g，煌绿0.0133g。
通过采用上述技术方案，胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌的生长。
进一步的，所述煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)的ph值为7.2±0.1。
通过采用上述技术方案，该ph范围适宜大肠菌群生长。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.通过将样品悬浮液低速离心，使得油性物质上浮于表面，且低速离心不影响大肠菌群的活性，利用移液枪吸取表层油状液体并弃之，防止油状物质对后续实验产生影响；
2.通过一级过滤，去除大颗粒渣粒，通过二级过滤，去除干扰物去除小分子干扰物质，达到菌体分离富集，随后收集菌体，并进行菌体检测即可。
具体实施方式
实施例1：
s1、在无菌台内取25g夫妻肺片样品，剪碎；
s2、将样品在5倍无菌盐水中进行均质处理，得到悬浮液；
s3、将s2中的悬浮液在离心中以1000r/s的速度离心4min；
s4、轻轻吸取表层油状液体，并弃之；
s5、均质s4中的剩余物质，加入吐温-60，助滤剂的量占稀释溶液重量百分比为千分之0.5，并将其以真空过滤法滤过28～32μm的一级滤膜，该一级滤膜的材质为聚丙烯，孔径为30μm；
s6、取s5中的滤后液过0.2～0.45μm的二级滤膜，该二级滤膜的材质为聚丙烯，孔径为0.3～0.4μm；
s7、用40ml无菌生理盐水分两次洗涤二级滤膜，大肠菌体截留在二级滤膜上；s8、洗脱二级滤膜上的大肠菌体，采用gb4789.3—2016中的mpn法进行大肠菌群检测。
mpn法选用月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)培养基和煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)培养基，两者的配方分别如下：
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，胰蛋白胨20g，氯化钠5.0g，乳糖5.0g，磷酸氢二钾2.75g，磷酸二氢钾2.75g，月桂基硫酸钠0.1g。ph调节为6.8±0.2。
煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，蛋白胨10g，乳糖10g，牛胆粉20g，煌绿0.0133g。ph调节为7.2±0.1。
s8-1、在无菌操作台上将s8中收集的实施例1样品中的大肠菌体分别稀释为0.1倍、0.01倍、0.001倍的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)，每管接种1ml，并放置于保温箱中，36℃±1℃培养24h，观察是否有气泡产生，其中稀释度为0.01倍的样品匀液产气，对其进行复发酵试验；
s8-2、在无菌操作台上用接种环从s8-1中产气的lst肉汤管中取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)管中，36℃±1℃培养48h±2h，结果没有产气，为大肠菌群阴性管。
实施例2：
s1、在无菌台内取25g夫妻肺片样品，剪碎；
s2、将样品在10倍无菌盐水中进行均质处理，得到悬浮液；
s3、将s2中的悬浮液在离心中以1500r/s的速度离心4min；
s4、轻轻吸取表层油状液体，并弃之；
s5、均质s4中的剩余物质，加入吐温-80，助滤剂的量占稀释溶液重量百分比为千分之2，并将其以真空过滤法滤过28～32μm的一级滤膜，该一级滤膜的材质为聚氯乙烯，孔径为30μm；
s6、取s5中的滤后液过0.2～0.45μm的二级滤膜，该二级滤膜的材质为聚氯乙烯，孔径为0.3～0.4μm；
s7、用100ml无菌生理盐水分两次洗涤二级滤膜，大肠菌体截留在二级滤膜上；s8、洗脱二级滤膜上的大肠菌体，采用gb4789.3—2016中的mpn法进行大肠菌群检测。
mpn法选用月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)培养基和煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)培养基，两者的配方分别如下：
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，胰蛋白胨20g，氯化钠5.0g，乳糖5.0g，磷酸氢二钾2.75g，磷酸二氢钾2.75g，月桂基硫酸钠0.1g。ph调节为6.8±0.2。
煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，蛋白胨10g，乳糖10g，牛胆粉20g，煌绿0.0133g。ph调节为7.2±0.1。
s8-1、在无菌操作台上将s8中收集的实施例1样品中的大肠菌体分别稀释为0.1倍、0.01倍、0.001倍的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)，每管接种1ml，并放置于保温箱中，36℃±1℃培养24h，观察是否有气泡产生，其中稀释度为0.001倍的样品匀液产气，对其进行复发酵试验；
s8-2、在无菌操作台上用接种环从s8-1中产气的lst肉汤管中取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)管中，36℃±1℃培养48h±2h，结果没有产气，为大肠菌群阴性管。
实施例3：
s1、在无菌台内取25g夫妻肺片样品，剪碎；
s2、将样品在8倍无菌盐水中进行均质处理，得到悬浮液；
s3、将s2中的悬浮液在离心中以1200r/s的速度离心4min；
s4、轻轻吸取表层油状液体，并弃之；
s5、均质s4中的剩余物质，加入吐温-80，助滤剂的量占稀释溶液重量百分比为千分之1，并将其以真空过滤法滤过28～32μm的一级滤膜，该一级滤膜的材质为纤维素酯类，孔径为30μm；
s6、取s5中的滤后液过0.2～0.45μm的二级滤膜，该二级滤膜的材质为聚碳酸酯类，孔径为0.3～0.4μm；
s7、用70ml无菌生理盐水分两次洗涤二级滤膜，大肠菌体截留在二级滤膜上；s8、洗脱二级滤膜上的大肠菌体，采用gb4789.3—2016中的mpn法进行大肠菌群检测。
mpn法选用月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)培养基和煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)培养基，两者的配方分别如下：
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，胰蛋白胨20g，氯化钠5.0g，乳糖5.0g，磷酸氢二钾2.75g，磷酸二氢钾2.75g，月桂基硫酸钠0.1g。ph调节为6.8±0.2。
煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，蛋白胨10g，乳糖10g，牛胆粉20g，煌绿0.0133g。ph调节为7.2±0.1。
s8-1、在无菌操作台上将s8中收集的实施例1样品中的大肠菌体分别稀释为0.1倍、0.01倍、0.001倍的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)，每管接种1ml，并放置于保温箱中，36℃±1℃培养24h，观察是否有气泡产生，其中稀释度为0.1倍的样品匀液产气，对其进行复发酵试验；
s8-2、在无菌操作台上用接种环从s8-1中产气的lst肉汤管中取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)管中，36℃±1℃培养48h±2h，结果没有产气，为大肠菌群阴性管。
实施例4(空白试验)：
s1、在无菌台内取25g带污染大肠菌群的夫妻肺片样品，剪碎；
s2、将样品在8倍无菌盐水中进行均质处理，得到悬浮液；
s3、将s2中的悬浮液在离心中以1200r/s的速度离心4min；
s4、轻轻吸取表层油状液体，并弃之；
s5、均质s4中的剩余物质，加入吐温-60，助滤剂的量占稀释溶液重量百分比为千分之2，并将其以真空过滤法滤过28～32μm的一级滤膜，该一级滤膜的材质为聚四氟乙烯，孔径为30μm；
s6、取s5中的滤后液过0.2～0.45μm的二级滤膜，该二级滤膜的材质为聚四氟乙烯，孔径为0.3～0.4μm；
s7、用80ml无菌生理盐水分两次洗涤二级滤膜，大肠菌体截留在二级滤膜上；s8、洗脱二级滤膜上的大肠菌体，采用gb4789.3—2016中的mpn法进行大肠菌群检测。
mpn法选用月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)培养基和煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)培养基，两者的配方分别如下：
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，胰蛋白胨20g，氯化钠5.0g，乳糖5.0g，磷酸氢二钾2.75g，磷酸二氢钾2.75g，月桂基硫酸钠0.1g。ph调节为6.8±0.2。
煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)包括以下组分组成：蒸馏水1000ml，蛋白胨10g，乳糖10g，牛胆粉20g，煌绿0.0133g。ph调节为7.2±0.1。
s8-1、在无菌操作台上将s8中收集的实施例1样品中的大肠菌体分别稀释为0.1倍、0.01倍、0.001倍的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)，每管接种1ml，并放置于保温箱中，36℃±1℃培养24h，观察是否有气泡产生，其中稀释度为0.1、0.01倍、0.001倍的样品匀液均产气，对其进行复发酵试验；
s8-2、在无菌操作台上用接种环从s8-1中产气的lst肉汤管中取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)管中，36℃±1℃培养48h±2h，结果三管均产气，为大肠菌群阳性管。
检测结果：
由上述表格可知，实施例1-3的夫妻肺片样品没有大肠菌群污染，实施例4的空白试验选用已污染的夫妻肺片做试验，结果显示为污染，说明本发明的检测方法有效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。