用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用的制作方法

本发明涉及动物亲子鉴定技术物领域，具体涉及用于穿山甲亲子鉴定的ssr荧光标记引物及应用。
背景技术：
：穿山甲是一种神秘的具有非典型形态特征的哺乳动物，隶属于哺乳纲(mammalia)鳞甲目(pholidota)穿山甲科(manidae)穿山甲属(manis)。长期以来，人们对穿山甲鳞片的药用需求，导致穿山甲的非法贸易日益严重，加上其栖息地大规模的破坏，使得穿山甲的野生种群数量急剧下降，目前现存8个种类(gaubertandantunes,2005；zhangetal.,2015)均被列入濒危野生动物国际贸易保护名录(conventiononinternationaltradeinendangeredspeciesofwildfaunaandflorai,citesi)。目前，栖息地的片段化和种群孤立化使得处于小种群的穿山甲极易发生近亲繁殖，致使其种质退化、生长性能和繁殖能力下降等问题十分突出。而且穿山甲的繁殖率较低，小种群中个体数量骤减后难以恢复，这些彼此隔离的小种群极易在局部地区灭绝。虽然就地保护是濒危物种保护工作的重要组成部分，但是为了扩大现生种群的规模、增加遗传多样性，人工繁育和迁地保护已经成为保护濒危物种的重要措施。穿山甲在人工饲养的条件下，可以保证获得全面的、充足的食物和营养，得到良好的健康保障，避免天敌伤害。因此，建立一个稳定的人工饲养种群，避免近交繁殖衰退和遗传漂变，增加有效种群大小，以采取与亲缘关系最小的个体进行长期基因交流为目的的选育及优化配对工作显得尤为重要。这样既可以满足国内外进行科学研究和公众教育的社会需求，又可以为圈养繁殖个体释放以补充野生种群创造一定的条件。早期的亲子鉴定将血型或酶型等作为遗传标记。目前，dna分子标记已经取代了传统的遗传标记，成为亲子鉴定研究中使用的重要遗传标记。微卫星标记由于其多态性丰富，序列两端呈现相对保守的单拷贝序列，等位基因数目高度可变，杂合度高，遗传稳定性较好，呈共显性遗传，因此被广泛的应用于构建基因图谱、遗传关系的确定、个体或群体亲缘关系鉴定之中。微卫星dna(microsatellite)又称为简单重复序列(simplesequencesrepeats,ssr)，是指一类重复单位在2-6个碱基的重复序列。ssr分子标记具有多态性高、共显性遗传、选择中性、易于操作等优点，获得结果可靠、方法简单、省时省力，很快发展成为一种极具价值的遗传标记，并被广泛的应用于个体间亲子关系鉴定、种群遗传分析、遗传疾病的诊断、基因定位、遗传图谱等研究领域。目前，还没有将微卫星分子标记应用到穿山甲亲子鉴定和遗传管理的报道，本发明旨在利用微卫星荧光标记建立马来穿山甲亲子鉴定技术，为解决穿山甲育种过程中，因小种群交配、不同亲本混养而导致的个体识别困难，谱系不清等难题，为穿山甲养殖场建立其家系谱系提供科学依据，以期合理的指导穿山甲人工种群的繁育保育工作。技术实现要素：本发明的目的在于提供用于穿山甲亲子鉴定的ssr荧光标记引物，该引物可用于穿山甲亲子鉴定。本发明的另外一个目的在于提供用于穿山甲亲子鉴定的ssr荧光标记引物的应用，包括利用该引物对穿山甲进行亲子鉴定，或利用该引物制备成用于穿山甲亲子鉴定的试剂盒。本发明通过以下技术方案来实现：根据穿山甲多组织混合样本获得其转录组，根据转录组数据中提供的微卫星位点设计引物；然后以穿山甲唾液样本dna为模板，使用微卫星标记引物进行pcr扩增，初步筛选pcr产物的多态性，获得多态性高的微卫星标记引物；将多态性高的微卫星标记引物进行fam荧光修饰，以穿山甲唾液样本dna为模板，进行pcr分析，对pcr产物进行基因型判定；根据基因型分析结果联合使用排除法与似然法进行亲子关系的鉴定。具体的，用于穿山甲亲子鉴定的ssr荧光标记引物，包括：m13mj-f2f:tttcataccgggaagtccac；r:atggtcctaacaccacggag；m13mj-f3f:cacctgcatgtacccctttt；r:ccccctcaaaataccacctt；m13mj-f4f:gagagaaaggggaaaatcgg；r:tgataggatgtgaggagggg；m13mj-f5f:tggggtctgctgttttcatt；r:ctccctctgtaggttgccct；m13mj-f7f:agaagtgatttgcacccctg；r:cagtggccagaatggagatt；m13mj-f8f:gtcatgcatggaagacagga；r:gtctggctgaaatggaaagg；m13mj-f9f:ccctatgaggtgggcactaa；r:aactccatcaaaggtgtggc；m13mj-f10f:cccagatccaaaatgaatgg；r:tgctgatgttcactcttgcc；m13mj-f11f:atccacctaggaacctcagc；r:gactcttcgggatttcacaca；m13mj-f12f:atccacctaggaacctcagc；r:gactcttcgggatttcacaca；m13mj-f16f:ttcccttcatctgttttgcc；r:cagcactgccaaggtctgta；m13mj-f17f:gtaatggggtatgtggtggg；r:tccctgttcaaacggaattt；m13mj-f20f:cagtgctcatcacatagcagg；r:catgcctagtgtttcacgttgm13mj-f24f:ttcagccagggtctctcagt；r:tggggtttttcctcaatctg；m13mj-f25f:ccagagaaaggtaggagcca；r:tccagaaaacagacccaagg。进一步的，对以上引物对正向5’端连接m13接头，合成5’端加m13接头的正向引物，m13接头序列为cacgacgttgtaaaacgac；对通用引物m13的正向5’端连接荧光基团，合成荧光基团修饰的m13正向引物，所述的通用引物m13的正向引物序列为cacgacgttgtaaaacgac。所述的荧光基团为fam。本发明的用于穿山甲亲子鉴定的ssr荧光标记引物的应用，包括利用该引物进行穿山甲亲子鉴定，或利用该引物制备成用于穿山甲亲子鉴定的试剂盒，或利用该引物进行种质鉴定和家系管理。一种穿山甲亲子鉴定的方法，包括以下步骤：a、合成上述15个引物对(m13mj-f2、m13mj-f3、m13mj-f4、m13mj-f5、m13mj-f7、m13mj-f8、m13mj-f9、m13mj-f10、m13mj-f11、m13mj-f12、m13mj-f16、m13mj-f17、m13mj-f20、m13mj-f24、m13mj-f25)正向5’端加m13接头的正向引物，所述的m13接头序列为cacgacgttgtaaaacgac；合成通用引物m13的正向5’端添加荧光基团的正向引物；所述的通用引物m13的正向引物序列为cacgacgttgtaaaacgac。b、提取穿山甲dna作为模板，使用上述15个引物对正向5’端加m13接头的正向引物、反向引物、通用引物m13的正向5’端添加荧光基团的正向引物，进行pcr扩增，对pcr产物进行基因型判定，采用cervus软件计算等位基因数，观测杂合度与期望杂合度，哈迪温伯格平衡检验，多态信息含量、单独排除率和累积排除率，根据基因型分析结果联合使用排除法与似然法进行亲子关系的鉴定。上述的穿山甲亲子鉴定方法中，pcr扩增程序采用降落pcr，具体条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s；退火温度30s从62至52℃，每2个循环降退火温度2℃，72℃延伸2min；95℃变性15s；52℃退火温度30s；72℃延伸2min；30个循环；72℃延伸10min。与现有技术相比，本发明的创新性和有益效果在于：(1)本发明提供的ssr荧光标记引物，可用于马来穿山甲亲子鉴定及家系管理，从而合理的指导穿山甲人工繁育工作，为保护穿山甲的遗传多样性，种群遗传机构等研究提供了强有力的工具；(2)本发明采用添加m13接头的方法，仅需合成一个m13荧光标记引物进行pcr扩展，从而节省了合成大量荧光引物所花费的成本和时间。附图说明图1为添加m13接头的荧光pcr反应原理图。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1马来穿山甲微卫星标记的筛选解剖取马来穿山甲(已死亡)舌、胃、大肠、胰腺、肝脏、唾液等样本进行混合研磨，提取总rna用于转录组测序、拼接、组装并查找微卫星位点。共检测出18693个ssr位点，其中单核苷酸重复序列12120个，二核苷酸重复序列3202个，三核苷酸重复序列1594个，四核苷酸重复序列259个，五核苷酸重复序列52个，六核苷酸重复序列23个。根据所获得的ssr位点，利用primer5设计56079对引物。使用动物组织dna小量提取试剂盒(hipuretissuednaminikit,magen)提取35只(雌性15只，雄性20只)马来穿山甲唾液样本dna，nanodropdn-1000紫外分光光度仪检测dna浓度和质量；将得到的dna用双蒸水稀释到100ng/μl的工作液，-20℃保存备用。以马来穿山甲唾液dna为模板，在已获得的微卫星引物中，随机选择40对引物并在其正向5’端添加m13序列(cacgacgttgtaaaacgac)进行合成，pcr扩增体系为10μl，包括100ng/μldna模板1μl，2×pcrmix5μl，ddh2o2μl，5’端加m13接头的正向引物1μl，反向引物1μl。扩增反应程序使用降落pcr(touchdownpcr)：95℃预变性10min；95℃变性15s；退火温度30s从62至52℃，每2个循环降退火温度2℃，72℃延伸2min；95℃变性15s；52℃退火温度30s；72℃延伸2min；30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pcr产物，初步分析筛选出具有多态性位点的15对引物(表1)。表1本发明中筛选到具有多态性的马来穿山甲微卫星引物序列信息实施例2多态性微卫星位点pcr扩增和基因分型(1)微卫星荧光标记引物pcr反应在通用引物m13的正向5’端添加fam荧光基团进行修饰(boutin-ganacheetal.,2001)，获得fam修饰的m13正向引物，m13正向引物序列为cacgacgttgtaaaacgac；对实施例1初步分析筛选出具有多态性位点的15对引物的正向5’端添加m13序列(cacgacgttgtaaaacgac)合成5’端加m13接头的正向引物。以实施例1提取获得的35只马来穿山甲唾液样本dna作为模板进行荧光pcr反应，扩增体系为10μl，包括100ng/μldna模板1μl，2×pcrmix5μl，ddh2o1.6μl，具有多态性位点的15对引物的正向5’端加m13接头的正向引物0.4μl，反向引物1μl，fam修饰的m13正向引物1μl(反应原理见图1，参考文献：boutin-ganacheetal.,2001.m13-tailedprimersimprovethereadabilityandusabilityofmicrosatelliteanalysesperformedwithtwodifferentallele-sizingmethods,biotechniques,31(1):25-28)。扩增反应程序使用降落pcr(touchdownpcr)：95℃预变性10min；95℃变性15s；退火温度30s从62至52℃，每2个循环降退火温度2℃，72℃延伸2min；95℃变性15s；52℃退火温度30s；72℃延伸2min；30个循环；72℃延伸10min，最后4℃避光保存。荧光引物扩增好的pcr产物，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其浓度，稀释至适合毛细管电泳检测的浓度，加入毛细管电泳分析所用的gs500liz内标，处理后放入abi3730xl高通量dna测序仪进行毛细管电泳和str分析以确定穿山甲微卫星标记在不同个体上的等位基因大小。(2)遗传多样性分析采用cervus软件计算等位基因数(k)，观测杂合度(ho)与期望杂合度(he)，哈迪温伯格平衡(hwe)检验，多态信息含量(pic)和候选亲本的排除率，以此来描述马来穿山甲相关微卫星dna多态性的特征。35只马来穿山甲dna样本中15个微卫星遗传标记多样性分析结果见表2，15个微卫星位点的核苷酸序列分别如seqidno.1-seqidno.15所示。其中，引物m13mj-f2扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.1所示；引物m13mj-f3扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.2所示；其中，引物m13mj-f4扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.3所示；其中，引物m13mj-f5扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.4所示；其中，引物m13mj-f7扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.5所示；其中，引物m13mj-f8扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.6所示；其中，引物m13mj-f9扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.7所示；其中，引物m13mj-f10扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.8所示；其中，引物m13mj-f11扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.9所示；其中，引物m13mj-f12扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.10所示；其中，引物m13mj-f16扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.11所示；其中，引物m13mj-f17扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.12所示；其中，引物m13mj-f20扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.13所示；其中，引物m13mj-f24扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.14所示；其中，引物m13mj-f25扩增出的微卫星位点的核苷酸序列如seqidno.15所示。由表2可知，15个微卫星位点检测到等位基因数范围为4-11个，平均等位基因数目为8个；观测杂合度在0.206-0.857之间，期望杂合度在0.454-0.869之间；多态信息含量(pic)值在0.413-0.84之间。从而证明本发明筛选的微卫星位点的引物具有较高的遗传多态性。当父母本遗传信息均未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的单独排除率(ne-pp)为0.117-0.599；当父母一方遗传信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的单独排除率(ne-2p)为0.317-0.752；当父母本双方遗传信息均已知时，排除子代与无关假设父母对是亲子关系的单独排除率(ne-1p)为0.53-0.896。累积排除概率ne-1p、ne-2p、ne-pp分别为0.9999、0.9999、0.995。表2马来穿山甲15个微卫星位点的多态性特征locusknhobshexppicne-1pne-2pne-pphwm13mj-f26350.6570.7060.6440.7210.5530.373nsm13mj-f36330.6060.740.6820.6860.5130.333ndm13mj-f45340.3820.650.60.7640.5880.397nsm13mj-f58320.4690.6920.6450.7140.5340.334nsm13mj-f711350.7430.8530.8210.4850.3170.145ndm13mj-f811320.4690.8690.840.4460.2850.117ndm13mj-f94340.2060.4540.4130.8960.7520.599ndm13mj-f109350.8570.8140.7770.5560.380.195ndm13mj-f119350.60.8220.7850.5460.370.189ndm13mj-f127350.4290.780.7370.6160.4350.246ndm13mj-f167340.3820.6730.6110.7510.5840.403nsm13mj-f1711350.6570.820.7890.530.3550.166ndm13mj-f209320.6250.8250.7890.5370.3620.179ndm13mj-f246320.6560.7090.6540.7130.5380.352nsm13mj-f258340.7350.7430.6920.6690.4910.302ns注：n为检测样本个体数；k为等位基因数；hobs为观测杂合度；hexp为期望杂合度；hw为哈迪温伯格平衡检验；pic为多态信息含量。一般认为，微卫星标记的等位基因数至少为4个时才能较好的用于物种的遗传分析及亲子鉴定。本发明共检测到等位基因117个，平均等位基因为8个，平均观察杂合度为0.565，平均期望杂合度为0.743，二者较小的差值说明这15个微卫星标记具有较好的基因杂合度，能够较准确的反应出群体的遗传特征。仅有累积排除率大于0.8时，利用微卫星标记鉴定的亲子关系才具有一定的可靠性，本发明中，15个微卫星标记累积排除率均>0.99。综上所述，本发明开发出了马来穿山甲15个具有多态性的微卫星位点以及扩增这15个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于马来穿山甲不同地理种群的遗传多样性研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。实施例3应用微卫星标记进行马来穿山甲亲子鉴定的应用举例应用上述15个微卫星标记联合使用排除法与似然法对35只马来穿山甲进行亲子关系鉴定，并将亲自鉴定的结果与饲养场系谱记录进行比对，以验证该方法的准确性。利用cervus3.0软件计算lod值在95％置信度为5.75，在80％置信度时为2。在置信度为95％时，鉴定到编号246与c46，a26与bb为母子关系；鉴定到a25与bb为父子关系。将亲自鉴定结果与谱系记录对比，得到的准确率为100％。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>广东省生物资源应用研究所<120>用于穿山甲亲子鉴定的ssr荧光标记引物及应用<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>200<212>dna<213>人工序列(m13mjf2)<400>1ttttcataccgggaagtccactgactacaggagactactagttaggtttctaggtttctg60cgatcttgacccaccttccatccatccatccatccatccatccatccatccagccagcca120gccagccattcaattaaaaatgtattggaactccgtggtgttaggaccatgatcaggcat180tcttcctctgaaagatgata200<210>2<211>230<212>dna<213>人工序列(m13mjf3)<400>2ccccttttctctcttatgtgtcgtacctggtttagatgacaattcatatgatcactctag60tcaagagtagctggttgatttttatttatttatttatttatttatttatttattttaaac120actgctggagaaaactgtgatgatgattgtatcttaagtgaatgatggccataatgggaa180aaacagaaaaagagaaggtggtattttgagggggaaaggtgggcataaat230<210>3<211>249<212>dna<213>人工序列(m13mjf4)<400>3tgtgaaataggagagaaaggggaaaatcggtaaagaattcattcattcattcattcattc60attcattcaacatatttattgagacctcataaatagcagaaataatcccaaatacttagc120atatggcagtgaacaagagagccaaaaatccctctcctaggtaagcctgtgtgtgacagc180gggtgtaggcaggaacaattacaaagacacatgaaacatatctgctgcccctcctcacat240cctatcagc249<210>4<211>219<212>dna<213>人工序列(m13mjf5)<400>4tggggtctgctgttttcattatagaatacttttagttaagacaaggaaaagtgaaaggaa60cagaagtctctttttaatagtccatatgaaaatctcatatgcaattaattaattaattaa120ttaattaattaattaatatttctctaaggtctcctggcttctgaaggtttatttagggca180acctacagagggaggaagaaataactgtgactcatgttc219<210>5<211>239<212>dna<213>人工序列(m13mjf7)<400>5agtgatttgcacccctgaggaaaggcctgacttctttttcggtcctctcctccttgttct60tatttctgtctgtttgtttgttcattttctcattcattcattcattcattcattcattca120ttcattcattcattcattcattcccatttgctgcctcaagtgcacccactttctcatggc180tgcacagggtttaagaggtgactttaatctccattctggccactgggtccatcatccca239<210>6<211>250<212>dna<213>人工序列(m13mjf8)<400>6gtcatgcatggaagacaggactaaggcaaatgctattatgattagagcactccaggtcat60gacactcactggatattgttttttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgttttgtt120tcaaagctattacaactaagggatgatgtgctcctctttttccttaccagtaaacatttt180agtggtagtggtatattaaatagcaaaaagttagtggccatccctttccatttcagccag240actaacccat250<210>7<211>300<212>dna<213>人工序列(m13mjf9)<400>7ccctatgaggtgggcactaatgttatttccatgtcacagatgaggaaacagaggaccagc60aaggtacagtcagttgcccaggccacacagccaggatttcagccctaaagtctgattcca120gagtttgagttctccattgagccctaccgtcgtttggatgaatgaatgaatgaatgaatg180aatgaatgagtgaatgaagcccccggggaggggacagcagggcccccactcctgcttaca240gcctttcccaccagctgccacacctttgatggagttttcccagaggggcctgtcttggga300<210>8<211>210<212>dna<213>人工序列(m13mjf10)<400>8cccagatccaaaatgaatggagccggaaattacctcatcagttggtattaatcagccaag60caattgacaggctgattgacaggctgggagcccctgaggctgttgacaaaggaacatgtt120gcttctggaatgaatgaatgaatgaatgaatgaatgaatggggcttgatgtttgatactg180tggaagtaaggcaagagtgaacatcagcaa210<210>9<211>260<212>dna<213>人工序列(m13mjf11)<400>9atccacctaggaacctcagctaacagcaactttctaggtctctgagttgattgatttaac60atgttaaatagatatagatagatagatggatagataatagatagatgatagatgatagat120acatagatgatagatgatagatgatagatagatagatagatagatagatagatagataga180tagatagatagaccaactgatcttgaaatgtgtgcatagtttgtaaactgtgtgaaatcc240cgaagagtctttgaagagaa260<210>10<211>249<212>dna<213>人工序列(m13mjf12)<400>10atccacctaggaacctcagctaacagcaactttctaggtctctgagttgattgatttaac60atgttaaatagatatagatagatagatggatagataatagatagatgatagatgatagat120acatagatgatagatgatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatag180atagaccaactgatcttgaaatgtgtgcatagtttgtaaactgtgtgaaatcccgaagag240tctttgaag249<210>11<211>249<212>dna<213>人工序列(m13mjf16)<400>11ttcccttcatctgttttgcccattctcctaacccacccagtttgttctctacatttatga60gcatttttctggttggttggttggttggttggttggttggttggttggttgttggttgtc120ttgtttaaaaaaaagaagggtaaaaccatatctttggaaatcaaataacactgaaaaaaa180tgctgatctgaagatgatgcacttacaccatctagaaaattgtacagaccttggcagtgc240tgccctatc249<210>12<211>219<212>dna<213>人工序列(m13mjf17)<400>12ctgtaatggggtatgtggtggggacttgataatggggggagtcagtaaccataatgttgc60tcatgtgattgtatattaatggtaccataataaataaatagatagatagatagatagata120gatagatagatagatagatagatagataatctgcagcgttatccatataagtagtttgct180gagagagtataattgaaattccgtttgaacagggaagat219<210>13<211>199<212>dna<213>人工序列(m13mjf20)<400>13cagtgctcatcacatagcaggtactcagaaagtaaaattagttcccttcttttagcctta60cttgatcataaccattggagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatag120atagatagatagatagatagatagcagtaagagatacaacgtgaaacactaggcatgtaa180attctcaaagaaaacaatt199<210>14<211>199<212>dna<213>人工序列(m13mjf24)<400>14ttcagccagggtctctcagtgactgctgagtagaacactctgaaggtccatgtcagtccc60atgaaataagaatgagaaagagactttgtatattaaccttctgatactttggtgctcttt120tttgttttgttttgttttgttttgttttgttttgttatagcaacataacagattgaggaa180aaaccccaaatactcatgc199<210>15<211>141<212>dna<213>人工序列(m13mjf25)<400>15ccagagaaaggtaggagccaaaagctgggggaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaac60aaaacaaaacaaaacaacactttgcagcctctaattctgggagtaaaaccttgggtctgt120tttctggagtgaggagggaag141当前第1页12