本发明属于生物农药
技术领域：
：，特别涉及一株莫海威芽孢杆菌菌株及其在防治梭罗草真菌病害、促梭罗草生长中的应用。
背景技术：
：：梭罗草为禾本科小麦族以礼草属多年生草本植物，在我国，梭罗草集中分布在青海、西藏等地，是青藏高原的特有种，青海省梭罗草主要分布在三江源区冷凉高海拔地。梭罗草固土能力强，抗寒耐旱、抗风沙、耐盐碱，适应于气候条件恶劣的高寒草原生境，是高寒草原植物群落的主要组成成分之一，可用于生态恢复。由于梭罗草富有营养而又易于动物消化，可作为饲料，从而缓解秋冬季节青藏高原草场枯黄后，饲料不足的现象。青藏高原海拔高、温度低、紫外强，特殊生境使高寒牧草普遍生长缓慢。近年来，由于鼠虫危害、过度放牧、对草场缺乏科学管理等因素，致使优良牧草退化，毒杂草滋生，加剧了高寒草甸草皮剥落，土壤裸露，生态环境恶化。退化草地的形成直接威胁着该地区牧民和家畜的生存发展，也威胁着三江源中下游地区的生态平衡。因此，加速牧草生长、恢复生态植被、提高生物含量，在高原草地生态环境恢复及治理中尤为重要。目前能够在青藏高原高寒草甸极端环境下发挥稳定功效，且针对于促梭罗草生长的生防菌株尚未有报道。其次，人工合成农药、化肥的大量使用在提高作物产量的同时对人类健康及生态环境带来了负面影响。化肥的长期使用会给高寒草甸带来残留及污染，毒杂草大量滋生，有害生物产生抗逆性，伤害非靶标生物甚至破坏高原生态平衡等一系列严重的问题。芽孢杆菌能产生耐热抗逆的芽孢，有利于生防菌剂的生产和加工，施用方便，储存期长，成为化肥、农药和其他微生态制剂的最佳竞争者。最为重要的为，现有的生防菌株的菌属过于单一，主要集中在枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，是否存在其他耐极端环境且高效促进梭罗草生长的生防菌株，是本研究的主要内容。莫海威芽孢杆菌(bacillusmojavensis)是一种噬温性的好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，能够抑制影响梭罗草生长的病原菌,若合理运用，将减少化学农药造成的环境污染、提高草场生态系统的生物多样性，保持高寒草甸生态平衡。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能适应青藏高原特殊生境，促进牧草如梭罗草生长、提高高寒草甸生物量的莫海威芽孢杆菌kkdd。本发明的另一目的在于提供一种包含上述菌株的菌剂和微生物肥料。本发明的有一目的在于提供上述的莫海威芽孢杆菌kkdd在促进牧草生长中的应用。本发明的目的可以通过以下技术方案实现：一株促牧草生长的莫海威芽孢杆菌，该菌株kkdd属于莫海威芽孢杆菌(bacillusmojavensis)，于2018年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.15579，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该kkdd菌株除了明显提高梭罗草生长的作用外，还具有降解秸秆木质纤维素、拮抗梭罗草产生真菌病害的作用。一种促牧草生长的菌剂，该菌剂中包含有上述的莫海威芽孢杆菌。一种促牧草生长的微生物菌肥，该微生物菌肥中包含有上述的莫海威芽孢杆菌。上述的莫海威芽孢杆菌在制备用于促牧草生长的微生物菌肥中的应用。上述的莫海威芽孢杆菌、菌剂或微生物菌肥在促牧草生长、降解木质纤维素或拮抗牧草真菌病害中的应用。一种促牧草生长的方法，为以下(1)～(3)中的至少一种：(1)采用上述菌株的发酵液对牧草种子进行浸种处理；(2)采用上述菌株的发酵液对牧草幼苗进行灌根处理；(3)采用上述的微生物菌肥对牧草进行施肥。上述的牧草优选为梭罗草。本发明的有益效果采用16s-rdna及gyrb基因扩增分析对分离筛选自青海省可可西里盐碱地点地梅根围细菌kkdd进行分子鉴定，菌株kkdd鉴定为莫海威芽孢杆菌bacillusmojavensis，该菌株耐盐碱能力较强，在含盐量为11％，ph＝11的条件下仍能正常生长。通过平板对峙试验检测该菌株拮抗病原真菌的活性，菌株对植物病原真菌小麦赤霉病菌(fusahumgraminearum)、锐顶镰孢菌(fusariumacuminatum)具有显著的拮抗活性，抑菌圈平均直径均≥15mm。通过salkowski比色法检测菌株产生iaa能力，菌株表现出较强产iaa能力，分泌量为19.904μg/ml，同时，菌株表现出稳定的固氮能力。以菌株发酵液对牧草种子进行浸种，检测菌株对植物的催芽及促生效果，菌株菌悬液浸种处理对梭罗草草种具有较强催芽促生效果，与对照相比，发芽率增加8％，菌株发酵液浸种法处理对牧草促生率为7.62％；以菌株发酵液对长势均一的梭罗草幼苗进行灌根处理，促生率为24.60％。分离自青海省可可西里盐碱地植被根围芽孢杆菌kkdd兼具固氮、拮抗病原菌、产iaa、催芽促生及耐盐碱特性，在高原草地植被恢复、生态农牧业中具有一定的研究及应用潜力。附图说明图1菌株kkdd的菌落形态图2菌株kkdd抑梭罗草病原真菌的效果a小麦赤霉病菌(fusariumgraminearum)，b锐顶镰孢菌(fusariumacuminatum)图3菌株kkdd所产脂肽类化合物a菌株kkdd产生的脂肽化合物的amaldi-tof-ms质谱图b血平板透明圈法检测菌株kkdd产生的脂肽类抗生素活性的结果图图4菌株促梭罗草生长具体实施方式实施例1：1.1菌株的分离申请人从青海省海西州可可西里(海拔：5500m，年均温为-10.0℃～4.1℃，年均降水量为173～495mm)盐碱地点地梅(androsaceumbellata)根围土壤中分离筛选得到一株菌株，将其命名为kkdd。本发明的菌株kkdd的分离纯化采用稀释涂布平板法、平板划线等方法。1.2菌株的鉴定1.2.1菌株的形态学鉴定通过观察菌落形态、颜色、边缘、透明度等，将菌株kkdd在lb(luria-bertan)培养基上平板划线培养。如图1所示，菌株kkdd的主要形态学特性为：在lb培养基上最佳的生长温度为25℃，培养1～2天后，形成直径2～3cm的菌落，菌落呈乳白色，不透明，菌落边缘不整齐，有皱褶；在lb液体培养基中，25℃过夜摇床培养，菌体生长旺盛，高度浑浊，产生絮状沉淀，有特殊气味。1.2.2菌株的分子鉴定提取细菌基因组dna，根据细菌16srdna及gyrb两端的保守系列，设计细菌的通用引物，16s-27f(5’-agagtttgatcmtggctcag-3’)，16s-1492r(5’-gcytaccttgttacgactt-3’)；gyrb-for(5’-gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga-3’)，gyrb-rev(5’-agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat-3’)。pcr扩增条件为：95℃4min；98℃10sec，62℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃8min。pcr反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后，送往深圳华大测序。以菌株kkdd基因组dna为模板扩增16srdna(如seqidno.1所示)及gyrb基因(如seqidno.2所示)，分别扩增到大小约1500bp、1300bp的pcr特征性条带，与芽孢杆菌16srdna、gyrb的理论值基本相符。将测序结果在ncbi中与genbank中已知序列进行blast比对。比对结果表明：菌株kkdd与bacillusmojavensisstrainlmb3g43序列(登录号：mf040277.1)相同(或一致)性为100％；菌株kkdd与bacillusmojavensisstrain28-1(登录号：kf194271.1)的gyrb序列相同(或一致)性为99％。经鉴定，该菌株kkdd属于莫海威芽孢杆菌(bacillusmojavensis)，并于2018年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.15579。1.3菌株kkdd的生理生化测定1.3.1耐酸碱性测定：吸取100μl培养至对数期的kkdd菌悬液加入10mlph分别为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0的lb液体培养基中，于37℃、180r/min恒温摇培3d，测定其od600值(以lb液体培养基为对照)，重复3次。菌株kkdd在ph小于5的强酸环境下不生长，随着酸度的降低，逐渐变为碱性环境时(ph7～11)菌体生长逐渐旺盛，当ph在11～13之间呈强碱环境时，菌体生长呈下降趋势。菌体在ph7～11时均能正常生长，这较于大多数细菌的最适ph(6.5～7.5)范围较宽。1.3.2耐盐性测定：吸取100μl培养至对数期的kkdd菌悬液加入10mlnacl浓度分别为0、3％、5％、7％、9％、11％、13％的lb液体培养基中，于37℃、180r/min恒温摇培3d,，测定其od600值(以lb液体培养基为对照)，重复3次。测定结果表明，菌株kkdd有很强的耐盐能力，在含盐量为5％的lb培养基中生长时，菌体的浓度最大，随着含盐量的增加，在含盐量超过11％时，菌体生长缓慢，菌体浓度呈下降趋势。菌体在含盐量为3％-11％的环境中均可生长，表明菌株的耐盐性较大多数细菌耐盐范围较宽。1.3.3耐低温测定：在lb培养基平板上，呈“十”字形分布的四个接种点，放置直径4mm滤纸小圆片，吸取5μl培养至对数期的kkdd菌悬液接种于滤纸片，每个处理重复3次，将培养基置于4℃、10℃、25℃、37℃条件下培养，观察并测量菌株在培养基平板上的生长状况。测定结果表明：菌株kkdd能够耐受4℃-10℃的低温，25℃时，生长最为旺盛，同时也能够在37℃环境中生长。1.3.4耐抗生素标记：将菌株kkdd分别接种于含50μg/ml利福平、卡那霉素的lb培养基上，在25℃培养5d后。挑选出生长状况良好的突变菌株，转入到含利福平、卡那霉素浓度分别50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的lb培养基中培养，重复5次。测定结果表明：菌株kkdd能够拮抗50μg/ml的利福平及50μg/ml的卡那霉素。1.3.5固氮能力测定：在ashby无氮培养基平板上，呈“十”字形分布的四个接种点，放置直径4mm滤纸小圆片，吸取5μl在37℃，200r/min条件下培养14h的菌悬液接种于滤纸片，每个处理重复3次重复3次，37℃恒温培养，观察并测量菌株在培养基平板上的生长状况。根据菌株在固氮培养基上形成的菌落大小，确定菌株kkdd的固氮能力，菌落越大，表示菌株固氮能力越强。菌株kkdd在ashby无氮培养基上形成明显的菌落，且经过3代连续培养后仍能形成明显菌落，在ashby液体培养基中继代培养3代后，菌液仍浑浊。1.3.6产吲哚乙酸活性测定：采用salkowski比色法，加入比色液(30ml0.5mol/lfecl3+30ml蒸馏水+50ml98％h2so4)之后15min观察颜色变化，3个重复均变红为阳性，表示能分泌吲哚乙酸iaa，颜色越深表示分泌数量多；3个重复均不变色为阴性，表示不分泌吲哚乙酸iaa；采用iaa标准曲线制作，将培养7d的菌悬浮液和对照离心(4℃，10000r/min，10min)，取上清液4ml加等量比色液，黑暗静置30min后测定od530，重复3次。根据标准曲线计算菌株kkdd分泌吲哚乙酸的量。在含有100mg/l色氨酸的lb培养液中，加入该细菌的比色液变红。采用iaa制作标准曲线。标准方程为：y＝19.057x+0.5991，kkdd在含色氨酸的lb培养液中，其比色液的od530为1.013，根据标准方程可计算出在含100mg/l色氨酸的金氏培养基中kkdd的分泌量为19.904μg/ml。1.4菌株kkdd拮抗活性测定1.4.1菌株kkdd抑真菌效果测定分别将在26℃培养箱中活化好的小麦赤霉病菌(fusahumgraminearum)、锐顶镰孢菌(fusariumacuminatum)pda平板边缘打取直径为0.7cm的菌碟,接种在新的pda平板中央。在距离菌块2.5cm处，呈“十”字形分布的四个接种点，放置直径4mm滤纸小圆片，吸取5μl在37℃，200r/min条件下培养14h的菌悬液，接种于滤纸片，每个处理重复3次，放入26℃恒温培养箱中培养2～3d后，取出观测并记录抑菌结果。如图2所示，通过平板对峙试验检测菌株拮抗活性，结果显示菌株kkdd对植物病原真菌小麦赤霉病菌(fusariumgraminearum)(如图2a)、锐顶镰孢菌(fusariumacuminatum)(如图2b)具有显著的拮抗活性，抑菌圈平均直径均≥15mm，表现显著的抑真菌效果。表1拮抗病原真菌活性table1antagonisticactivitytopathogenicfungus注：+：抑菌圈半径0-5mm；++：抑菌圈直径5-10mm；+++：抑菌圈直径10-15mm；++++：抑菌圈直径>15mm.note:+:inhibitionzoneradius0-5mm；++:inhibitionzoneradius5-10mm；+++:inhibitionzoneradius10-15mm；++++:inhibitionzoneradius≥15mm.1.4.2菌株kkdd的maldi-tof-ms质谱测定生防菌株b.mojavensiskkdd通过landy发酵后提取并获得脂肽化合物，对脂肽化合物进行maldi-tof-ms分析，检测菌株可产生的脂肽化合物的种类和组成。如图3a所示，结果表明：b.mojavensiskkdd在m/z值为1485.790、1499.799处有离子峰(簇)出现，这2个离子峰均对应于fengycin的质量；在m/z值为1030.83、1044.75、1058.75处有离子峰(簇)出现，这3个离子峰均对应于surfactin的质量。maldi-tof-ms质谱图分析表明，菌株kkdd可产生脂肽类化合物fengycin、surfactin。1.4.3菌株kkdd的脂肽类抗生素抑血平板实验如图3b所示，通过血平板透明圈法检测供试菌株产生的脂肽类抗生素的活性，结果显示菌株b.mojavensiskkdd提取的脂肽化合物粗提物在血平板上形成直径为17mm的透明圈，表明菌株产生的脂肽化合物均具有抗生素活性，可以通过与红细胞膜上的磷脂双分子层相互作用形成离子通道，破坏膜结构，使细胞内容物释放，引起血细胞死亡。1.5菌株kkdd促梭罗草生长1.5.1菌株kkdd促梭罗草种子幼苗萌发试验表明，将梭罗草种子经菌株kkdd发酵液浸种2h(有效菌含量为：1×107cfu/ml)，培养5d后，测定生防芽孢杆菌促梭罗草种子萌发效果。结果表明：供试菌株kkdd发酵液对梭罗草草种有较明显的促萌发效果，与对照相比，经发酵液处理的梭罗草种子发芽率为92％，对照组发芽率为80％，与对照组相比发芽率增加12％。1.5.2菌株kkdd促梭罗草幼苗生长将梭罗草种子经菌株kkdd发酵液浸种2h(有效菌含量为：1×107cfu/ml)，培养15d后，测定生防芽孢杆菌对梭罗草幼苗的促生效果。如图4所示，结果表明：供试菌株kkdd菌悬液对梭罗草幼苗有明显的促生效果，与对照相比，经均处理的梭罗草幼苗的平均株高达到12.15cm，与对照组相比增加7.62％，株高显著性提高。将梭罗草种子经20％次氯酸钠溶液中消毒处理，将种子在无菌条件下播入穴盆中，待植株株高达到5-6cm时，以浓度为1×107cfu/ml发酵液灌根菌株，10d后测定菌株对梭罗草幼苗的促生效果。结果表明：供试菌株kkdd菌悬液对梭罗草幼苗有明显的促生效果，与对照组相比增加24.60％，梭罗草株高显著性提高。经多次实验比较，浸种法促生效果优于灌根法，菌株kkdd在促进梭罗草幼苗生长的同时，也提高了梭罗草的鲜重、干重及叶绿素含量。表2芽孢杆菌促植物幼苗生长效率table2theeffectofplantseedlingpromotedbybacillusspp.(seedsoaking)表3菌株kkdd促植物幼苗生长效率(灌根法)table3theeffectofplantseedlingpromotedbykkdd(rootirrigation)16s序列(seqidno.1)：cagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggttccttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaagyrb序列(seqidno.2)：cgggctttttccaagttgacatcttccccgatacctgtgccgagtgcagtaatcatagaacgaacttcgttgttagaaagaattttatcaagccttgctttttcaacgtttaggattttacctcttagcggcaaaatggcttggaaatgcctgtcacgtccctgttttgcagatcctccggcagagtcaccctctacgatatataactcggagatgctcgggtctttcgaagagcagtccgctaatttaccgggaaggtttgaaatctccaaagcgcttttgcggcgcgttaattcacgcgcttttttcgcagccattcttgctcttgctgccattaaacctttgtcaacgattttttttgccgcatctggattttccagcataaatgtttccaacgccgcagaaaataacgtatctgtgatcgtccgcgcctctgagttgcctagttttgttttcgtttggccttcgaactgcggatccgggtgtttgatcgagataatcgcggtaagcccttctctcacatcatctccgcttaagtttggatcattttcttttatgagtcctttttttctggcgtaatcattgatgacacgagtcagccccgttttaaaaccggcttcgtgggtaccgccttcgtacgtgttgatattgtttgtaaatgagtaaatattgcttgtgtagctgtcattgtattgcagagcgacttcaaccgtaatgccgtccttttcgccttcaatataaatcggctcttcatggacaacttctttggagcggtttaaatactctacatagcttttaattccgccttcgtaatgatactcatttttgcgctcttggccttcacgtttatcttcaatcgtgatgtttacgccttttgtcaaaaaggctaattcgcgaacacggttagcaagcaaatcatattcatactcagttgtttccgtgaagatttcaggatctggaacaaagtgtgtagtcgttcctgtatgatccgtttcgccaataacctcaagatcagaaaccgggacaccgcggttatagacttggcgatggatttttccgtcacggtgaacagtcacatcaagctctgttgataacgcgttaaa序列表<110>青海大学<120>一株促梭罗草生长的莫海威芽孢杆菌及其应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agagtttgatcmtggctcag20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcytaccttgttacgactt19<210>3<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga41<210>4<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat44<210>5<211>1407<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacct60gcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgtttgaacc120gcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcat180tagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggt240gatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaa300tcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcgg360atcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgac420ggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtg480gcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggttccttaagtctgat540gtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaa600gaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagt660ggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaac720aggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggttt780ccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaag840actgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattc900gaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggac960gtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgaga1020tgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgg1080gcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatc1140atgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaa1200ccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcg1260actgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcc1320cgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgag1380gtaacctttatggagccagccgccgaa1407<210>6<211>1103<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgggctttttccaagttgacatcttccccgatacctgtgccgagtgcagtaatcatagaa60cgaacttcgttgttagaaagaattttatcaagccttgctttttcaacgtttaggatttta120cctcttagcggcaaaatggcttggaaatgcctgtcacgtccctgttttgcagatcctccg180gcagagtcaccctctacgatatataactcggagatgctcgggtctttcgaagagcagtcc240gctaatttaccgggaaggtttgaaatctccaaagcgcttttgcggcgcgttaattcacgc300gcttttttcgcagccattcttgctcttgctgccattaaacctttgtcaacgatttttttt360gccgcatctggattttccagcataaatgtttccaacgccgcagaaaataacgtatctgtg420atcgtccgcgcctctgagttgcctagttttgttttcgtttggccttcgaactgcggatcc480gggtgtttgatcgagataatcgcggtaagcccttctctcacatcatctccgcttaagttt540ggatcattttcttttatgagtcctttttttctggcgtaatcattgatgacacgagtcagc600cccgttttaaaaccggcttcgtgggtaccgccttcgtacgtgttgatattgtttgtaaat660gagtaaatattgcttgtgtagctgtcattgtattgcagagcgacttcaaccgtaatgccg720tccttttcgccttcaatataaatcggctcttcatggacaacttctttggagcggtttaaa780tactctacatagcttttaattccgccttcgtaatgatactcatttttgcgctcttggcct840tcacgtttatcttcaatcgtgatgtttacgccttttgtcaaaaaggctaattcgcgaaca900cggttagcaagcaaatcatattcatactcagttgtttccgtgaagatttcaggatctgga960acaaagtgtgtagtcgttcctgtatgatccgtttcgccaataacctcaagatcagaaacc1020gggacaccgcggttatagacttggcgatggatttttccgtcacggtgaacagtcacatca1080agctctgttgataacgcgttaaa1103当前第1页12当前第1页12