一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的β-1,3葡聚糖内切酶及其编码多核苷酸的制作方法

本发明涉及一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的葡聚糖水解酶β-1,3葡聚糖内切酶及其编码基因核苷酸，属于生物技术领域，生产的酶制剂用于食品，医药，饲料，洗涤等工业，不仅可以解决富含葡聚糖的生物质废料的再利用问题，还可以取得丰富的葡聚寡糖产生可观的经济效益。

背景技术：

葡聚糖是植物和微生物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30％～50％，是地球上分布最广、含量最丰富的可再生碳源化合物，占地球总生物量的40％。据报道，我国每年光作物秸杆、稻梗、海带等含葡聚糖较丰富的生物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物生物质高达1.55×10⁹吨，其中尚有89％未被人们利用，而大量的秸杆、稻梗等含葡聚糖丰富的生物质利用率很低，大多采用燃烧的方法来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，葡聚糖生物质的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等有重大的意义。

葡聚糖酶是分解葡聚糖的一类酶，它能将葡聚糖分解为单分子葡萄糖或低分子量寡糖，充分的利用了葡聚糖生物资源。自1906年sellieres在蜗牛消化液中发现β-1,4葡聚糖酶以来，葡聚糖内切酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株和分离纯化寻找葡聚糖酶，再应用到食品、医药、饲料、纺织、洗涤和能源等工业中，不仅解决了葡聚糖的再利用问题还取得了很可观的经济效益。

葡聚糖酶是多酶组分的一个复杂酶系，主要来自于软体动物、植物、真菌和细菌。根据酶功能的不同，分为三大类：葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。采用基因工程手段构建高效表达菌株可以实现葡聚糖酶的大量表达，目前有近100多个葡聚糖酶基因可在大肠杆菌中克隆和表达，主要是葡聚糖内切酶和β-葡萄糖苷酶。葡聚糖内切酶基因的获得在葡聚糖生物质高效利用领域有巨大的应用潜力，同时可通过对葡聚糖内切酶的生物活性进行探索，以期更好得开发利用葡聚内切糖酶资源，实现生物量的转化利用和酶制剂多功能化，这对人类的可持续发展具有非常重要的意义。

魁蚶(arcainflatareeve)属于动物门，瓣鳃纲，蚶目，蚶科，是我国资源丰富的海产生物之一。魁蚶个大体肥，肉质鲜美，古书中记载魁蚶有“令人能食、益血色、消血块和化痰积”之功效，营养价值和经济价值很高，是我国及亚洲沿海地区重要的经济贝类之一。通过查阅相关文献资料发现，国外学者从魁蚶中表征和表达了一种具有抗菌活性和免疫调节活性的多肽，而魁蚶葡聚内切糖酶的研究未见报道。故魁蚶葡聚糖内切酶将高价值利用魁蚶这一海洋生物资源，扩大葡聚糖内切酶资源的同时具有重大经济意义，为合理、高效利用海洋资源提供理论依据。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是提供一种具有免疫增强活性的β-1,3葡聚糖内切酶及其编码基因核苷酸，属于生物技术领域，生产的酶制剂用于食品，医药，饲料，洗涤等工业，不仅可以解决富含葡聚糖的生物质废料的再利用问题，还可以取得丰富的葡聚寡糖产生可观的经济效益。

技术方案

本发明提供的魁蚶(arcainflatareeve)β-1,3葡聚糖内切酶，分子量51.03kda，其氨基酸序列为seqidno.1。

本发明涉及的魁蚶(arcainflatareeve)β-1,3葡聚糖内切酶是按照如下方法制备的：

将新鲜魁蚶(arcainflatareeve)剥壳、取出内容物清洗，加入磷酸盐缓冲液匀浆提取，离心，取上清液，硫酸铵分级沉淀，取70-100％盐析沉淀复溶透析脱盐，采用离子交换柱层析分离，收集酶活性峰，透析脱盐后经疏水层析柱分离，收集酶活性峰，透析脱盐后经空间排阻凝胶柱分离，得到魁蚶(arcainflatareeve)中β-1,3葡聚糖内切酶。

本发明还公开了从魁蚶(arcainflatareeve)中分离的β-1,3葡聚糖内切酶的编码基因，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为999bp，g+c含量为43.77％，其核苷酸序列为：seqidno.2。

本发明还公开了含有所述魁蚶(arcainflatareeve)β-1,3葡聚糖内切酶的编码基因的重组表达质粒和含有重组质粒的重组微生物e.colibl21(de3)。

本发明涉及的魁蚶(arcainflatareeve)β-1,3葡聚糖内切酶的重组表达质粒和含有重组质粒的重组微生物e.colibl21(de3)是按照如下方法制备的：

用分别含ndei和hindiii的正反向pcr引物从阳性克隆子中扩增出魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶基因片段；经ndei和hindiii双酶切后和同样用这两种酶切好的pet-28a(+)进行酶连，酶连好的含魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶基因的pet-28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌e.colibl21(de3)获得重组微生物e.colibl21(de3)，转接到含有50mg/l卡那霉素的平板，37℃培养16h后挑取阳性转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。

上述魁蚶(arcainflatareeve)β-1，3葡聚糖内切酶及其编码基因可以在食品，医药，饲料，洗涤等工业中得到应用。

有益效果

1.以海洋经济贝类魁蚶为材料，运用现代生化分离技术，如磷酸盐缓冲液提取，硫酸铵沉淀，离子交换层析、疏水层析和空间排阻层析，分离纯化出β-1,3葡聚糖内切酶(葡聚糖降解过程中的关键酶之一)及其编码基因。

2.该酶包含333个氨基酸，编码基因全长为999bp，g+c含量为39.34％。

3.通过pcr技术扩增末端含ndei和hindiii酶切位点的完整的β-1,3葡聚糖内切酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高表达载体pet-28a(+)(购自novegen公司)的ndei和hindiii酶切位点上，转化表达宿主菌e.colibl21(de3)(购自invitrogen公司)，进行iptg诱导表达。

4.本发明对分离的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶及其编码基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的水解昆布多糖(laminarin)，比活力为90.01u/mg，在以昆布多糖(laminarin)为底物时的kd值为13.09μm，薄层层析色谱(tlc)能够将昆布多糖水解为葡聚寡糖分子。

5.魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适ph和ph稳定性的测试结果表明，本发明魁蚶β-1，3葡聚糖内切酶的最适ph为6.0，在ph5.5-7.5范围内均很稳定，在此ph范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上。魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适温度和热稳定性的测试结果表明，魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适温度为40℃，在45℃下温育60min，酶活力仍保留60％以上。不同金属离子化学试剂对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的影响测试结果表明，大部分金属离子和化学试剂对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力没有明显影响，mn²⁺和mg²⁺在2mm时对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力有促进作用，cu²⁺、zn²⁺和ba²⁺在2mm时对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力有明显抑制作用。

6.魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶除可作用于昆布多糖外，对于茯苓多糖(pachyman)和大麦葡聚糖(barleyglucan)也有一定的降解作用。其对茯苓多糖的降解能力相对于昆布多糖的为78.72％，其对大麦葡聚糖的降解能力相对于昆布多糖的为40.18％。

7.魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶能够显著增强raw264.7细胞免疫活性，诱导一氧化氮和细胞因子tnf-α、白细胞介素il-6释放。

8.利用该基因构建的重组工程菌株能高效表达魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶(活性β-1,3葡聚糖内切酶蛋白的含量约占细胞总蛋白含量的30％)，生产的酶制剂可用于食品、医药、饲料、洗涤和能源等工业。

四、附图说明

图1sds-page检测分离的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶，其中m为蛋白marker,j2c1g1为魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶；

图2魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对昆布多糖的结合常数kd测定结果；

图3魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适ph测定结果；

图4魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的ph稳定性测定结果；

图5魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适温度测定结果

图6魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的热稳定性测定结果；

图7魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对raw264.7细胞活力的影响测定结果

图8魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对raw264.7细胞吞噬活性的影响测定结果

图9魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对raw264.7细胞一氧化氮释放的影响测定结果

图10魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对raw264.7细胞肿瘤坏死因子(tnf-α)释放的影响测定结果

图11魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对raw264.7细胞白细胞介素6(il-6)释放的影响测定结果

五、具体实施方式

1.魁蚶β-1，3葡聚糖内切酶的分离纯化

将魁蚶剥壳，取其内容物，用低温蒸馏水清洗三次，控干后称重，按照1：3的重量比例加入提取缓冲液(ph＝8.0，0.03mol/l，磷酸钠缓冲液)，采用高速组织捣碎机，以8000×g间隔匀浆3min至细腻无块状，将匀浆液置于低频超声仪中超声提取40min，使用低温高速离心机，10000×g，4℃，离心30min去渣，量取上清液的体积后将其置于冰浴环境中加入70％饱和度的硫酸铵后，继续搅拌盐析1h后，高速离心除去沉淀取上清液，量取体积后加入100％饱和度的硫酸铵，再继续搅拌盐析1h后，10000×g，4℃，离心30min，收集沉淀。将沉淀用少量提取液溶解后置于3000d透析袋中透析24h以除盐，每间隔6h更换外周蒸馏水。将具有酶活性盐析组分使用deae-sepharosefastflow阴离子交换层析进行分离，用ph为8.0的0.03mol/l的tris-hcl缓冲液作为初始洗脱液，通过增加氯化钠的浓度进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰，收集具有β-1，3葡聚糖内切酶活性的0.1mol/l氯化钠洗脱的洗脱液，透析脱盐后，再使用phenylsepharosecl-4b疏水层析柱分离。首先用1.0mol/l，ph为8.0的硫酸铵-磷酸缓冲液进行洗脱，然后依次用含0.5mol/l和0mol/l的硫酸铵-磷酸钠缓冲液(ph8.0)进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰，收集含有1.0mol/l硫酸铵的磷酸钠缓冲液洗脱的洗脱液，透析脱盐后，再经分子排阻凝胶sephadexg50层析柱分离。使用含有0.1mol/l氯化钠的磷酸钠缓冲液进行等度洗脱，收集第一个洗脱峰，浓缩冷冻干燥，得到了魁蚶中β-1，3葡聚糖内切酶。用聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page检测该分离的酶的纯度达到了电泳纯(图1)。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱maldi-tof-ms测定该酶的分子量是51027.83da，用圆二色谱和jasco蛋白二级结构评估软件分析其二级结构组成。魁蚶β-1，3葡聚糖内切酶用胰酶酶解和电喷雾电离串联质谱esi-ms/ms结合魁蚶转录组数据库比对解析了该酶的氨基酸序列和编码基因核苷酸序列。

2.魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶基因在e.colibl21(pet-28a(+))中的高效表达

2.1魁蚶(arcainflatareeve)rna提取和cdna反转录

使用e.z.n.a.totalrnakiti(r6834-01，omegabiotech公司制造)提取魁蚶rna。将新鲜魁蚶组织液氮速冻研磨，取30mg研磨好的组织粉末加入500ul的trk裂解缓冲液裂解细胞，15000g离心5min。转移上清至homogenizationspincolumn中，13000g离心3min，将离心收集的流出液转移到新的ep管中。在裂解产物中加入50％体积的无水乙醇混匀，漩涡振荡20s。样品转移到hibindrnaminicolumn后10000g室温离心30s，弃去流出液(透过柱子流出到离心管里的液体)。将柱子放在一个新的2ml收集管中，依次用500ulrnawashbufferi和500ulrnawashbufferii洗涤柱子，13000g离心弃掉流出液。dnasei消化，除去可能残存的dna。转移柱子到一个新的1.5ml的ep管中，加入50μl的depc水洗脱柱子，13000g离心1min回收rna至ep管中。

使用timesavercdna合成试剂盒(phamaciabiotech公司制造)进行cdna合成。首先将5μg的mrna溶解于20μl的样品缓冲液。于65℃进行10分钟的热变性处理后，与二硫苏糖醇溶液以及寡聚物(dt)引物一起加到第一条链合成混合物中，于37℃反应1小时。然后再都加到第二条链合成混合物中，于12℃反应30分钟，再于22℃反应1小时，得到魁蚶cdna。

2.2β-1,3葡聚糖内切酶基因的pcr扩增

以正向引物：

5’-ggaattccatatggaattccgatcacactaagccgttaacacctca-3’和反向引物：

5’-cccaagcttgggtcaattttggttcattacctctaaaatgacttcca-3’为引物，用pcr从魁蚶cdna中扩增出β-1,3葡聚糖内切酶基因片段。

扩增体系：

pcr扩增程序：

a.98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸1.5min，进行30个循环；

b.72℃延伸10min；

c.15℃冷却10min。

2.3pcr产物用ndei和hindiii双酶切。

酶切体系：

在37℃水浴中，反应3h以上。

酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2.4pet-28a(+)用ndei和hindiii双酶切(参考2.2)。

2.5转化和表达

2.3中的回收片段和2.4中酶切好的pet-28a(+)进行酶连。酶连好的含β-1,3葡聚糖内切酶基因的pet-28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌e.colibl21(de3)获得重组微生物e.colibl21(de3)。涂布含有50mg/l卡那霉素的平板，挑取阳性转化子，经测序验证基因序列无误。阳性克隆子在lb培养基中37℃培养至od6000.5-0.6之间，加iptg至浓度0.5mm，18℃继续培养24h。收集菌体用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)重悬后，用超声处理破碎菌体细胞，20000g离心15min，所得上清即为粗酶液，经镍柱分离，500mm咪唑洗脱得到纯化的重组魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶。

2.6魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对不同多糖底物的水解功能

取200μg魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶加至1ml含有1％多种多糖底物(昆布多糖、酵母多糖、茯苓多糖、羧甲基纤维素钠、琼脂糖、大麦葡聚糖)的50mm的柠檬酸钠缓冲液中，于40℃反应30min后，用dns法测产物葡萄糖的生成量。酶活力单位u定义为40℃反应条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖。结果表明(表1)魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对昆布多糖水解作用最好，酶活力为90.01u/mg，即1mg该酶以1％昆布多糖为底物在最适条件下反应每分钟可获得90.01μmol葡萄糖。魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶能够迅速将昆布多糖水解，产生单糖、二糖、三糖、四糖等寡糖分子。采用微量热泳仪测定该酶与昆布多糖的结合常数，结果表明(图2)在以昆布多糖为底物时的结合常数kd值是13.09μm。魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶可用于食品、医药、饲料、纺织、洗涤和能源等工业。

表1魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对不同多糖底物的酶活力

2.7魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶最适温度、最适ph、ph和温度稳定性、金属离子化学试剂对酶活力的影响

魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适温度的测定在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)缓冲液体系及不同温度下以昆布多糖为底物进行酶促反应。耐温性测定为葡聚糖酶在不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃)下处理60min，再在40℃下以昆布多糖为底物进行酶活性测定。酶反应最适温度结果表明(图3)魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适温度为40℃。酶的热稳定性测定结果表明(图4)魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶在40℃以下具有完全的酶活力，在45℃下温育60min，酶活力仍保留60％以上。

魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适ph的测定使用不同缓冲液体系(柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、tris缓冲液、mops缓冲液、mes缓冲液)，在40℃下不同ph反应体系以昆布多糖为第五进行酶促反应。ph稳定性实验在不同ph的不同缓冲液中40℃下进行葡聚糖酶活力测定。酶反应最适ph结果表明(图5)魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶最适ph为6.0。酶的ph稳定性测定结果表明(图6)魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶在ph5.5-7.5范围内均很稳定，在此ph范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上。

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶活性的影响，各种物质终浓度为2mm。在40℃、ph6.0条件下测定酶活性。结果表明(表2)大部分金属离子和化学试剂对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力没有明显影响，mn²⁺和mg²⁺在2mm时对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力有促进作用，cu²⁺、zn²⁺和ba²⁺在2mm时对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力有明显抑制作用。

表2不同金属离子对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶活力的影响

2.8魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶免疫活性测试

2.8.1魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对raw264.7细胞增殖的影响

将raw264.7细胞与含有10％胎牛血清(fbs)，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem溶液在5％co2的气氛中于37℃一起培养。将细胞接种到96孔板(2×10⁴个细胞/孔)中并孵育24小时。用不同浓度的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶处理细胞48小时。通过mtt测定确定细胞活力。所有实验重复3次，数据表示为平均值±标准偏差(sd)。

raw264.7细胞分别用一系列浓度为31.25—500μg/ml的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶和0.1μg/ml脂多糖(lps)处理。lps具有显著的激活巨噬细胞的能力。结果表明(图7)即使在500μg/ml的高浓度下，魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶也明显不影响细胞活力。因此，魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对raw264.7细胞没有细胞毒性。

2.8.2魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对吞噬作用的影响

将raw264.7细胞接种到96孔板(1×10⁴细胞/孔)中并孵育24小时。用不同浓度的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶处理细胞24小时。将培养基和1μg/ml脂多糖(lps)分别用作空白对照和阳性对照。通过中性红摄取测定法测定raw264.7细胞的吞噬活性。吞噬活性的增强是巨噬细胞活化最显着的特征之一。结果表明(图8)，与lps对照相比，所有测试浓度的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶都能显著的增强吞噬细胞，且呈现剂量依赖性。因此，魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶具有显著的免疫增强活性。

2.8.3魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶对一氧化氮(no)和细胞因子释放的影响

将raw264.7细胞接种到96孔板(1×10⁵个细胞/孔)中并孵育24小时。用不同浓度的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶处理细胞另外24小时。将培养基和lps(1μg/ml)分别用作空白对照和阳性对照。然后，使用no检测试剂盒检测每个孔中培养基中的no含量。通过elisa进行各孔培养基中细胞因子肿瘤坏死因子tnf-α和白细胞介素il-6的定量。将培养基和lps(1μg/ml)分别用作空白对照和阳性对照。活化的巨噬细胞是先天免疫的重要效应物。当巨噬细胞被激活时，它们可以分泌越来越多的促炎分子，包括no和细胞因子，如tnf-α和il-6。结果表明(图9)与对照组相比，魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶可以极大地诱导raw264.7巨噬细胞释放no。此外，结果表明(图10和图11)raw264.7细胞在不同浓度的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶处理后，tnf-α和il-6的产生也得到了有效的提高。因此，魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶具有明显的免疫增强活性。

序列表

<110>于荣敏

<120>一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的β-1,3葡聚糖内切酶及其编码多核苷酸

<130>2018.11.10

<160>4

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