一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

半纤维素是植物细胞壁的主要成份之一，而木聚糖是半纤维素中的代表性组份。木聚糖是由d-吡喃型木糖残基以β-1,4糖苷键连接而成，其侧链上还连接有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等取代基。这些侧链的水解与否对于木聚糖主链的降解度具有极大影响，对于阿拉伯木寡糖的生物活性至关重要。因此，阿拉伯呋喃糖苷酶常作为饲料添加剂用以促进反刍动物对半纤维素的消化吸收，也是工业上木质纤维素糖化酶系的必要组份。

阿拉伯呋喃糖苷酶能水解α-l-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-l-阿拉伯呋喃糖苷残基，并分类为ec3.2.1.55。在植物阿拉伯木聚糖中，阿拉伯呋喃糖苷残基连接在木糖残基上的c2或c3位置（单取代），或两者都有连接（双取代）。已知从多种生物体，包括细菌、真菌中分离或异源表达了阿拉伯呋喃糖苷酶。然而很多阿拉伯呋喃糖苷酶存在热稳定性差或者只能水解一种取代类型的糖苷键的缺陷。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关现有技术中存在的问题之一。为此，本发明提出一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用。

本发明的一个方面，提供一种热稳定性强的阿拉伯呋喃糖苷酶abf51，其氨基酸序列如seqidno.1所示，该酶包括493个氨基酸，n端无信号肽，理论分子量为56kda。

本发明还提供了编码上述阿拉伯呋喃糖苷酶的基因abf51，基因全长1482bp，该基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明从高温纤维素降解菌clostridiumclariflavumdsm19732基因组中重组异源表达了一种高活性的并热稳定性强的阿拉伯呋喃糖苷酶abf51。它不仅对木糖残基上的c2或c3位置单取代的阿拉伯糖残基均有较高的水解活力，而且对c2与c3位置的双取代残基也表现出一定的水解活力。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适ph6.5，最适温度60℃。abf51具有很高的催化活力：对3²-α-l-阿糖呋喃-木二糖（3²-α-l-arabinofuranosyl-xylobiose，a³x）及对硝基苯基-α-l-阿拉伯呋喃糖苷(p-nitrophenyl-α-l-arabinofuranoside，pnpaf)两种底物的vmax分别高达783.1与664.6u/mg。在最适条件下，abf51对2³-α-l-阿糖呋喃-木三糖（2³-α-l-arabinofuranosyl-xylotriose，a²xx）或3²-α-l-阿糖呋喃-木二糖（3²-α-l-arabinofuranosyl-xylobiose，a³x）侧链阿拉伯糖残基的水解度分别可达97%以上。同时abf51也具有出色的耐热性：在其最适温度（60℃）下保温2天，本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶的残余活力仍高达90%；保温6天，残余活力仍可达68%。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶对产物阿拉伯糖也表现出一定的耐受性，相应的ic50约为200mm。这些优良特性表明其具有相当的工业应用潜力。

本发明的另一方面，还提供了一种重组表达载体，所述载体包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51，为peasye2-abf51。所述重组载体是将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到表达载体peasye2唯一的平末端克隆位点，使其核酸序列与载体上的表达调控序列相连接，得到重组表达载体peasye2-abf51。

本发明的再一方面，还提供了一种重组菌株，所述重组菌株包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51。

本发明还提供了一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的制备方法，包括以下步骤：

（1）用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

（2）培养重组菌株，诱导重组阿拉伯呋喃糖苷酶的表达；

（3）回收并纯化所表达的阿拉伯呋喃糖苷酶abf51。

本发明的再一方面，还提供了上述阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的用途，根据本发明的实施例，所述阿拉伯呋喃糖苷酶abf51用于对半纤维素的降解，具体的，根据本发明的实施例，为对阿拉伯糖残基的降解。

seqidno.1：

mlkaivnadikkgkinkniyghfsehlgrciyegiwvgedseipnikgyridvlealkklkvpvlrwpggcfadeyhwmdgigprekrpcminthwggvvennhfgthefmefcemigaepyisgnlgsgtvqemqqwveyitfdgkspmadlrrangreepwklkyfgignenwgcggnmraeyyadlykryatyvrnfgdnviykiacgpsagdytwtevvmreaghllnglslhyytlptnswtgskgsatefgeeewfktlkhtlvmeelvtkhsiimdkydpekkiglivdewgawydvepgtnpgflyqqntlrdaliaginlnifnnhcdrvqmaniaqlvnvlqaviltegdkmlltptyhvfdmykvhqdadllsvefeniyytygdekipqvsisssqdkdgkihisicnlnpsqsvdvdfeirgtavqkvkgqivtdqemnarntfedsnrikvevfndakiennhavckipsksvvvleie

seqidno.2：

atgctgaaagctatagtaaatgcggatattaagaagggaaagataaacaaaaatatatacggacatttttcggaacatctcggaagatgtatttatgaaggaatatgggttggagaagactctgagattccaaacataaaaggataccgtatcgatgtgcttgaagcactgaaaaaattgaaagtgcctgtcttaaggtggccgggcggatgttttgcggatgaatatcattggatggatggaattggtccaagggagaagagaccttgcatgattaatacccattggggtggcgtggttgaaaataaccacttcggaacccatgagtttatggaattctgtgaaatgattggagctgaaccctatatttccggtaatctcggaagcggtacagtgcaagaaatgcagcagtgggtagaatatattacctttgacggaaaatcaccgatggcagatttgagaagggcaaacggaagagaagagccgtggaagttaaaatacttcggtattggaaatgaaaactggggatgcggtggaaatatgagagcggaatattacgcagacctttataaaagatatgcaacttatgtaaggaattttggtgacaatgttatttataagattgcatgtggtcccagtgcaggggattatacatggacggaagttgtgatgagagaagcaggacatctattgaatggattaagtctgcattactatactttgccgacaaattcctggacaggttcaaaaggttcagctactgaattcggtgaggaagaatggtttaaaacactcaaacacacactggttatggaagaattggttacaaaacacagtatcatcatggataaatatgatcctgagaagaaaattggcttgattgttgatgaatggggtgcatggtacgatgtagaaccgggtaccaatccgggattcctctatcagcagaatacgctgagagatgctttgatagccggtattaatctgaatattttcaataaccattgcgacagagttcaaatggcaaacatagctcaattggtcaatgttcttcaggcggtaattcttactgaaggcgataaaatgcttctgacaccgacatatcatgtttttgacatgtataaggttcatcaggatgcagaccttctgtcggttgagtttgaaaatatatattatacctatggtgatgaaaaaataccgcaggttagcatttcgtcatcccaagataaagacggaaaaatccatatttcaatttgtaatctcaatccttcccagagtgttgatgtagactttgaaataaggggaactgcagtgcagaaggtaaaaggacagatagtgactgatcaggaaatgaatgcaagaaatacctttgaagacagtaatcgaataaaagttgaagtattcaacgatgcaaaaatagaaaataaccatgctgtatgtaagattccgtcaaaatccgttgtggttttggaaatagaataa

本发明的优势如下：

本发明提供一种性质优良，具有工业应用潜力的阿拉伯呋喃糖苷酶，本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶最适ph为6.5，最适温度60℃。具有极强的热稳定性，在60℃下保温2天，其残余活力仍高达90%，保温6天，其残余活力仍可达68%。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶对对木糖残基上的c2或c3位置单取代的阿拉伯糖残基均有较高的水解活力：对a²xx与a³x的kcat分别为55.2与743.9s^-1；而对双取代的阿拉伯糖残基底物（a²⁺³xx）的kcat则为15.9s^-1。

本阿拉伯呋喃糖苷酶可应用于多种工业应用。例如，饲料产品制备，从生物质生产燃料乙醇，糖化用于啤酒生产，食品加工中的生面团改性等等。

附图说明

图1是大肠杆菌中表达的重组阿拉伯呋喃糖苷酶的sds-page分析；其中，泳道1：通过60℃下热处理30分钟后初步纯化的abf51蛋白；泳道2：蛋白质marker；泳道3：通过镍柱纯化达到单一条带的abf51蛋白。

图2是重组阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度确定的结果。

图3重组阿拉伯呋喃糖苷酶的最适ph确定的结果。

图4重组阿拉伯呋喃糖苷酶的热稳定性验证结果。

图5重组阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯糖的耐受性结果。

图6重组阿拉伯呋喃糖苷酶酶促进小麦阿拉伯木聚糖水解结果。

具体实施方式

试验材料和试剂:

1.菌株及载体：本发明从纤维素降解细菌clostridiumclariflavumdsm19732（购自德国菌种库，菌株编号dsm19732）中分离得到一种新的热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶abf51。大肠杆菌表达载体peasye2、高保真pcr酶kdplus、菌株trans1-t1与bl21购自于全式金公司，表达载体peasye2自带dna拓扑异构酶i用于目的基因连接。

2.生化试剂：对硝基苯基-α-l-阿拉伯呋喃糖苷(p-nitrophenyl-α-l-arabinofuranoside，pnpaf)、水溶性小麦阿拉伯木聚糖、2³-α-l-阿糖呋喃-木三糖（2³-α-l-arabinofuranosyl-xylotriose，a²xx）、3²-α-l-阿糖呋喃-木二糖（3²-α-l-arabinofuranosyl-xylobiose，a³x）与2³3³-α-l-二阿糖呋喃-木三糖（2³3³-di-α-l-arabinofuranosyl-xylotriose，a²⁺³xx）购自megazyme公司；细菌基因组dna提取试剂盒购自生工生物工程公司；其它试剂为国产分析纯试剂（均可从普通化学试剂公司购买得到）；重组gh10木聚糖xyna来自thermomyceslanuginosusdsm5826（erkangyinetal.,worldjmicrobiolbiotechnol,2008,24:275-280），重组β-木糖苷酶xyl43c来自clostridiumclariflavumdsm19732（aleigengetal.,bioresources,2017,12:9253-9262）。

3.培养基：lb培养基，成份为酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l。

实施例1:

细菌clostridiumclariflavumdsm19732中阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因abf51的克隆及表达载体构建：

按照基因组提取试剂盒的说明提取clostridiumclariflavumdsm19732的基因组dna（基因组genbankid：cp003065.1），设计引物abf51f，abf51r，载体通用引物为t7r，引物序列如下：

abf51f（seqidno.3）：5’-atgctgaaagctatagtaaat-3’；

abf51r（seqidno.4）：5’-ttctatttccaaaaccacaac-3’；

t7r（seqidno.5）：5’-tgctagttattgctcagcgg-3’。

以clostridiumclariflavumdsm19732的基因组dna为模板进行pcr扩增。pcr反应参数为：首先94℃变性4min；接着94℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸2min，进行32个循环；然后68℃延伸10min。回收约1.5kb的dna片段，将该片段与peasye2表达载体连接转化大肠杆菌克隆宿主trans1-t1，用abf51f引物和载体通用引物t7r进行pcr检测，pcr反应条件同上。阳性克隆送生工生物工程公司测序。该步骤同时获得含有阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的重组质粒peasye2-abf51。

测序显示阿拉伯呋喃糖苷酶abf51编码基因全长1482bp，编码493个氨基酸和一个终止密码子，与genbank相应的基因序列相同（cp003065.1上2807554至2809035间的碱基）。该蛋白无信号肽，蛋白理论分子量为56kda。

实施例2：重组阿拉伯呋喃糖苷酶的制备

按照大肠杆菌bl21感受态细胞转化说明书，将含有阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的重组质粒peasye2-abf51转化大肠杆菌bl21感受态细胞，获得重组大肠杆菌菌株bl21/abf51。

将菌株bl21/abf51接种于500mllb培养基中，37℃200rpm震荡培养3小时至od1.2左右。添加iptg诱导物至终浓度0.15mm，于30℃120rpm继续震荡培养15小时，重组阿拉伯呋喃糖苷酶表达量为27.0u/ml（以pnpaf为底物测定）。经热处理及镍柱纯化之后，重组阿拉伯呋喃糖苷酶在sds-page上呈单一条带（图1），其大小约为56kda，与理论预测一致。

实施例3：重组阿拉伯呋喃糖苷酶的酶学特性分析

（1）重组阿拉伯呋喃糖苷酶最适温度的确定：

在ph6.5下，测定不同温度下重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51对pnpaf的相对活力，以最高活力为100%，此活力对应最适温度。反应步骤：取20μl13.3mm的pnpaf底物母液，加入30μl200mm磷酸钠缓冲液（ph6.5）以及140μl水，最后加入10μl适当稀释的酶液，于20～85℃下反应3min，加入等体积2%的na2co3终止反应，于410nm下测定od值，以无酶的空白反应为对照。结果表明阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的最适温度为60℃（图2）。

（2）重组阿拉伯呋喃糖苷酶最适ph的确定：

测定不同ph下重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51对pnpaf的相对活力，以最高活力为100%，此活力对应最适ph。反应步骤：取20μl13.3mm的pnpaf底物母液，加入30μl200mm不同ph的缓冲液以及140μl水，最后加入10μl适当稀释的酶液，于60℃下反应3min，加入等体积2%的na2co3终止反应，于410nm下测定od值。ph4.0至6.0采用醋酸钠缓冲液，ph6.5至8.0采用磷酸钠缓冲液，而ph8.5至10.0则采用甘氨酸缓冲液，以无酶的空白反应为对照。结果表明阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的最适ph为6.5（图3）。

（3）重组阿拉伯呋喃糖苷酶的酶学常数测定：

阿拉伯呋喃糖苷酶对pnpaf比活力的测定方法：采用前面步骤确定的最优反应条件及反应体系，在最适温度（60℃）及最适ph（6.5）下测定阿拉伯呋喃糖苷酶对pnpaf（终浓度6.65mm）的水解活力。于410nm下测定pnpaf被水解后生成的产物对硝基苯酚的量。1u定义为每分钟释放的对硝基苯酚的微摩尔数。

阿拉伯呋喃糖苷酶对a²xx，a³x，a²⁺³xx比活力的测定：利用视差检测器于高压液相色谱仪器上检测底物被水解后生成的阿拉伯糖的量。反应步骤：将一定量5g/l的底物母液（a²xx，a³x或a²⁺³xx）溶于15μl磷酸钠缓冲液（ph6.5），加入5μl适当稀释的酶液，用水补足200μl，于60℃反应10min，加入20μl160mm的h2so4以终止反应，并置于冰上。利用视差检测器检测生成的阿拉伯糖的量。此处1u定义为每分钟释放的阿拉伯糖的微摩尔数。

类似地，设置不同底物浓度梯度，根据双倒数作图法确定阿拉伯呋喃糖苷酶对以上四种底物的米氏反应常数km、kcat以及vmax。阿拉伯呋喃糖苷酶对以上四种底物的酶学特性见表1。阿拉伯呋喃糖苷酶abf51对pnpaf、c2位单取代的底物a²xx、c3位单取代的底物a³x、以及c2、c3位双取代的底物a²⁺³xx均具有较高的催化效率，并且阿拉伯呋喃糖苷酶abf51催化效率（kcat/km）由强到弱的顺序为pnpaf、a³x、a²xx、a²⁺³xx。abf51对a³x及pnpaf的kcat分别高达743.9与631.4s^-1。

表1阿拉伯呋喃糖苷酶abf51对不同底物的酶学特性

（4）重组阿拉伯呋喃糖苷酶的耐热性：

将重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51酶液分别于60℃或70℃下热处理1～7天，测定重组酶对pnpaf的残余活力。以未进行热处理酶液的活力为100%，所得耐热特性见图4。重组酶abf51在60℃保温2天残余活力高达90%，保温6天残余活力仍可达68%；重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51在70℃保温1天残余活力60%左右，保温2天残余活力仍可达40%。

（5）重组阿拉伯呋喃糖苷酶的产物耐受性：

添加不同浓度的l-阿拉伯糖（终浓度0～500mm），于最适反应条件下（60℃ph6.5）测定重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51对pnpaf的相对活力。以未添加阿拉伯糖时的活力为100%，所得阿拉伯糖耐受性见图5。200mm的阿拉伯糖可对重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51产生约50%的活力抑制，这说明abf51具有较好的阿拉伯糖产物耐受性。

实施例4：重组阿拉伯呋喃糖苷酶对阿拉伯木寡糖侧链的水解

本实施例中，重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51可以直接对木糖残基上的c2或c3位置单取代的阿拉伯糖残基进行充分的水解。反应体系为：5g/l底物（a²xx或a³x）100μl，0.2mph6.5磷酸钠缓冲液200μl，酶液10μl（6.7u），水补足1ml。于60℃反应1小时，经过高压液相色谱检测，a²xx或a³x侧链阿拉伯糖残基的水解度分别可达99.2%与97.2%。对低浓度底物的高转化效率说明了重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51对木糖残基上的c2或c3位置单取代的阿拉伯糖残基具有很高的水解效率。

实施例5：重组阿拉伯呋喃糖苷酶促进阿拉伯木聚糖的水解

阿拉伯木聚糖的充分水解依赖于木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶以及β-木糖苷酶三种酶的协同作用。固定木聚糖酶xyna及β-木糖苷酶xyl43c的用量，添加不同量的重组阿拉伯呋喃糖苷酶abf51，检测复合酶系水解小麦阿拉伯木聚糖所生成的阿拉伯糖及木糖的产量。

本实施例中木聚糖酶用量为333u/（g底物），β-木糖苷酶用量为1345u/（g底物），重组阿拉伯呋喃糖苷酶用量为0～1128u/（g底物）。反应条件为：55℃，ph6.5，底物终浓度为18.5g/l，反应时间为24小时。

结果如图6所示，在不添加阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的情况下，阿拉伯糖产量接近0，木糖产量为1.77g/l；在添加阿拉伯呋喃糖苷酶abf51的情况下，随着其用量增加，木糖、阿拉伯糖产量也逐渐增加，最高分别可达7.2g/l与3.9g/l。这说明阿拉伯呋喃糖苷酶abf51不仅实现了对阿拉伯糖侧链的水解，还极大地促进了木聚糖的水解（产量提升至4倍）。

阿拉伯木聚糖是禾本科植物秸秆、种皮中半纤维素的主要成份，在以禾本科植物秸秆进行糖化、生物乙醇炼制过程中，阿拉伯呋喃糖苷酶abf51具有潜在的应用价值。在以禾本科植物果实进行酿酒、食品加工、饲料深加工过程中，阿拉伯呋喃糖苷酶abf51也具有潜在的应用价值。

序列表

<110>江苏大学

<120>一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>493

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<213>梭菌(clostridiumclariflavum)

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<213>梭菌(clostridiumclariflavum)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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