一株决明属根瘤菌JYN6及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株决明属根瘤菌jyn6及其应用。

背景技术：

我国约有5690万hm²酸性土壤，占总耕地面积42.2%以上。近年来，随着大量化学氮肥的施用，土壤酸化日趋严重。我国酸性土壤主要集中在长江以南地区，该地区光、热、水等资源丰富，但土壤瘦瘠、粘重、ph值低及养分有效性低，严重制约了该地区农业的快速发展。在生产上，往往通过施用大量化肥来提高作物产量。但是大量化肥的投入不仅会导致土壤板结及进一步酸化，而且还会造成水体富营养化和地下水的污染，严重破坏生态环境。

通过种植豆科植物结合根瘤菌接种技术，来改良土壤、提高土壤肥力是目前较为认可的一种途径。豆科植物能与根瘤菌结合形成互利互惠的共生关系。根瘤菌从宿主植物得到生长所需的碳水化合物及其他养分，而宿主植物则从根瘤菌生物固氮过程中获取氮素营养，以达到提高农作物产量和降低化肥使用量的效果，进而在减少水土污染的同时保持农业的可持续发展。

决明属植物(chamaecristaspp.greene.)是热带、亚热带地区重要的豆科植物，包括乔木、灌木和草本等三类。圆叶决明(chamaecristarotundifolia(pers.)greene)原产于澳大利亚，是决明属半直立型多年生豆科草本植物，具有固氮效率高、耐贫瘠、生物量较大、花色艳丽，特别适应酸性土壤等特性。1996年，福建省农业科学院从澳大利亚牧草种质资源中心引进圆叶决明，并将其作为改良酸性土壤的豆科绿肥型牧草，在福建、广东和广西等酸性土壤地区推广种植。但是，圆叶决明在自然条件下结瘤慢且少、固氮效率较低，严重影响其种植及推广应用。因此，为提高圆叶决明的结瘤率和固氮效率，急需筛选出结瘤率高和固氮能力强的根瘤菌菌株，以提高决明属牧草的固氮效率，进而达到培肥地力和改善生态环境的效果。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一株决明属根瘤菌jyn6，该菌株的分类命名为根瘤菌（bradyrhizobiumsp.）jyn6，是慢生根瘤菌属的新菌株系，于2018年4月10日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018192，保藏地址为：武汉大学。该菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特点。

本发明的另一个目的是将上述根瘤菌jyn6应用在豆科决明属植物共生固氮中，通过提高圆叶决明的生物固氮能力，促进其生长，达到决明生产中减肥增效的目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案来实现的：

1根瘤菌菌株的分离和纯化

1）取羽叶决明新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；

2）放入95%（w/v）的酒精中处理3~5分钟，再放入0.1%（w/v）hgcl2中，灭菌3~5分钟，取出后用无菌水冲洗5~6次；

3）在火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向yma培养基表面划线，倒置后在28℃下培养。yma培养基的配方如表1所示：

表1yma（yeastmannitolagar）培养基配方

4）待长出菌体后，用枪头从平板上刮取少量根瘤菌菌落，加1ml无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3d之后观察菌落情况，一直观察到15d(慢生根瘤菌需7~15d出现菌落)。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落。

5）待长出单克隆菌体后，根据以下两个方面判断其是否为根瘤菌：

①菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养3~5d菌落直径达2~4mm为快生型根瘤菌，培养7~10d菌落直径为1mm则为慢生型根瘤菌。

②nodagene的pcr检测：挑取上述形态根瘤菌单克隆进行nodagenepcr检测，引物分别为noda-f和noda-r，正向引物seqidno.1：noda-f5’-tgcrgtggardctrygctgggaaa-3’；反向引物seqidno.2：noda-r5’-gnccgtcrtcraasgtcargta-3’。酶选用2×starmix，分别用根瘤菌bxyd3的基因组dna和水为模板做阳性对照及阴性对照。nodagene长度为666bp，运用电泳成像技术观察其在666bp处是否具有条带，具有条带的菌落为根瘤菌。其pcr反应体系如表2：

表2nodagene2×starmix酶反应体系

反应条件：94℃5min；（94℃30s，55℃30s，72℃1min）×35cycle；70℃5min。

2根瘤菌jyn6的性质

1)形态特征

该菌株在菌落形态上，为慢生型，圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多。在yma平板上生长5~7d后的直径为0.8~2.0mm(附图1)。

2)培养特性

该菌的最适生长条件为：ph＝7.0，温度28℃，转速180r/min，可利用甘露醇和酵母粉分别作为其碳源和氮源。

3)基因特性

经nodagenepcr、电泳成像检测，在666bp处具有较亮条带(附图2)。

4)功能特性

根瘤菌jyn6具有结瘤率高和固氮能力强等特点。菌体被释放到自然环境中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而丰富了土壤间根瘤菌的群体多样性，对决明属牧草的结瘤固氮具有明显的促进作用。

根瘤菌jyn6的16srdna分子生物学鉴定

为鉴定根瘤菌菌株的系统发育地位，对所分离到的根瘤菌进行16srdna的pcr特异性扩增，测序正向引物seqidno.3：v4v5515-f5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’；测序反向引物seqidno.4：v4v5907-r5’-ccgtcaattcctttgagttt-3’；测序所得根瘤菌jyn6的16srdna序列如seqidno.5所示；其pcr反应体系如表3：

表316srdna2×starmix酶反应体系

反应条件：95℃5min；（95℃20s，55℃20s，72℃50s）×44cycle；70℃5min。

从ncbi(genbank)数据库中获取13个参比菌株序列，运用软件bioedit和mega6对分离菌株和参比菌株的16srdna部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树。从而确定根瘤菌jyn6为慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)的新菌株系(附图3)，并命名为安羽1号。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明的根瘤菌jyn6具有结瘤率高和固氮能力强的特性。回接试验发现，与不接种根瘤菌相比，接种该根瘤菌30d分别提高圆叶决明鲜重和干重161.78wt%和213.49wt%，可用于实际生产；2)圆叶决明接种本发明的根瘤菌jyn6，极显著地提高了植株全氮含量(p<0.01)，从而达到促进圆叶决明植株生长和培肥地力的目的；3)本发明的根瘤菌jyn6适用于南方酸性土壤地区，能作为圆叶决明常规栽培的重要措施之一。

附图说明

图1根瘤菌jyn6在yma培养基上的菌落形态；

图2根瘤菌jyn6经nodagenepcr、电泳成像检测所成图像；其中，+代表用根瘤菌bxyd3的dna做阳性对照，-表示用水做阴性对照。

图3根瘤菌jyn6的16srdna部分序列分析系统发育树；其中，分支上的数字表示可信度；括号内容表示在genebank中的登录号；比例尺表示100个核苷酸里有2个替换。

图4根瘤菌jyn6蛭石回接效果图；ck：空白对照。

图5接种根瘤菌jyn630d后圆叶决明结瘤数及根瘤固氮酶活性；a：圆叶决明结瘤数；b：圆叶决明根瘤固氮酶活性；ck：空白对照。

图6接种根瘤菌jyn630d后对圆叶决明生长的影响；其中，a：圆叶决明鲜重；b：圆叶决明干重；c：圆叶决明株高；d：圆叶决明spad值；e：圆叶决明植株含氮量；ck：空白对照；*：0.01<p<0.05，**：0.001<p<0.01，***：p<0.001。

具体实施方式

实施例1根瘤菌jyn6的分离和纯化

1根瘤菌的分离

取羽叶决明新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分。先放入95%（w/v）的乙醇中处理3~5分钟，取出用无菌水冲洗5~6次，再放入0.1%（w/v）hgcl2灭菌3~5分钟，取出用无菌水冲洗5~6次。然后于火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向yma(表1)培养基表面划线，倒置后在28℃下培养。

2纯化

待长出菌体后，用枪头从平板上刮取少量根瘤菌菌落，用1ml无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3d之后观察菌落情况，一直观察到15d(慢生根瘤菌需7~15d出现菌落)。

根据以下两个方面可初步判断是否为根瘤菌：

①菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质或多或少。培养3~5d菌落直径达2~4mm为快生型根瘤菌，培养7~10天菌落直径达1mm则为慢生型根瘤菌。

②nodagenepcr检测：挑取上述形态根瘤菌单克隆进行nodagenepcr检测，引物分别为noda-f和noda-r，酶选用2×starmix，分别用根瘤菌bxyd3的基因组dna和水为模板做阳性对照及阴性对照。此及基因的条带长度大约为666bp，运用电泳成像技术观察菌株jyn6在666bp处具有较亮条带，初步判定其为根瘤菌。然后加入等体积50%（w/v）甘油放-80℃保菌。

本实施例根瘤菌jyn6为慢生型根瘤菌，在菌落形态上为圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多；在yma平板上生长5~7d后的直径为0.8~2.0mm（附图1）；最适生长条件为：ph=7.0，温度28℃，转速180r/min，可利用甘露醇和酵母粉分别作为其碳源和氮源；经nodagenepcr、电泳成像检测，其条带与阳性对照根瘤菌bxyd3的基因组dna为模板的条带一致(基因长度为666bp，如附图2)。

运用此分离纯化方法，经过4代反复纯化，在yma固体培养基（表1）中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经蛭石回接试验验证其结瘤固氮能力，本实施例分离纯化到结瘤率高和固氮能力强的菌株jyn6。

实施例2根瘤菌jyn6的16srdna分子生物学鉴定

对根瘤菌单克隆菌液进行16srdna的pcr特异性扩增，正向引物为seqidno.3：v4v5515-f5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’；反向引物为seqidno.4：v4v5907-r5’-ccgtcaattcctttgagttt-3’。酶选用2×starmix。pcr扩增产物做电泳成像技术进行检测，观察其是否具有条带，将剩余pcr扩增产物用于序列测定。测序结果如seqidno:5所示。其pcr反应体系如表4。

表416srdna2×starmix酶反应体系

反应条件：95℃5min；（95℃20s，55℃20s，72℃50s）×44cycle；70℃5min。

从ncbi(genbank)数据库中获取13个参比菌株序列，运用软件bioedit和mega6对分离菌株和参比菌株的16srdna部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树(附图3)。从而确定根瘤菌jyn6为慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)的新菌株系，并命名为安羽1号。

实施例3回接试验

试验目的：筛选出和决明属牧草具有较高结合效率且固氮能力较强的根瘤菌。

试验材料：供试植物：闽育1号圆叶决明；供试菌株：分离纯化的根瘤菌。

主要试验仪器和器材：人工气候生长室、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、15×15cm的盆栽盆25个、1l的烧杯2个、镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒、剪刀和纱布等。

试验药品和试剂：

(1)试验药品：甘露醇、mgso4∙7h2o、nacl、酵母粉、k2hpo4、kh2po4、caco3、ca(no3)2∙4h2o、mgso4·7h2o、cacl2·2h2o、na2hpo4·12h2o、c10h12n2o8fena·3h2o、na2moo4、mnso4、h3bo3、cuso4·5h2o和znso4·7h2o。

试验试剂：

1）yma(yeastmannnitolagar)液体培养基：称取甘露醇10g，mgso4∙7h2o0.2g，nacl0.1g，酵母粉3g，k2hpo40.25g，kh2po40.25g，caco33g(保存时添加)，琼脂15g溶于1l纯水中。

2）植物低氮营养液：ca(no3)2∙4h2o0.03g，mgso4·7h2o0.28g,cacl2·2h2o0.10g，kh2po40.10g，na2hpo4·12h2o0.15g，c10h12n2o8fena·3h2o0.0075g，微量元素1ml，蒸馏水1000ml，ph5.5。微量元素配方(g∙l^-1):na2moo40.03g，mnso41.81g，h3bo32.86g，cuso4·5h2o0.8g，znso4·7h2o0.22g。

试验步骤

（1）菌株培养

将-80℃保存的供试菌株转接于yma液体培养，培养至对数期，即od值达到1~1.2。

（2）灭菌处理

将试验所需用的盆栽盆、烧杯、镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒、纱布、剪刀包好，将蛭石用保鲜袋装好，121℃，灭菌30min。yma液体培养基、蒸馏水用瓶子装好，121℃，灭菌20min。

将供试植物种子浸入80℃的热水中浸泡3min，使种皮软化，胶状物析出，并用清水反复冲洗干净，之后将圆叶决明种子经75%（w/v）酒精处理15min，用无菌水冲洗5~6次，用10%（w/v）h2o2进行表面消毒4min，再用无菌水冲洗7~8次，最后放入带有滤纸的培养皿28℃下催芽10h，待胚根长出0.2cm即可。

（3）蛭石栽培及接种

(1)将纱布条穿过灭过菌的盆栽盆的底部，然后将灭过菌的蛭石盛装于灭过菌的盆栽盆中，使植物低氮营养液通过纱布条引到基质和植物根部，以保证圆叶决明生长发育对营养和水分的需求。然后将盆栽盆套在装有营养液的烧杯中。用锡箔纸包裹此上下两层装置，以避免营养液在光照条件下长青苔。

(2)将处理过的圆叶决明种子穴播于蛭石中，将圆叶决明种子接种根瘤菌菌液，每盆2ml，菌含量为10亿个每毫升，最后盖上厚1cm的蛭石。置于生长室中(光周期为：日/夜=16h/8h，温度为：日/夜=26℃/24℃)培养。

以不接种根瘤菌菌液为空白对照，做3个重复，接种30d后收获，以植株鲜重、干重、结瘤数、植株含氮量、根瘤菌固氮酶活性、spad值和株高作为测定根瘤菌结合性和固氮能力的判断指标。

结果分析

如图5所示，空白对照(ck)无结瘤现象，回接处理平均每5棵圆叶决明可结瘤32.08个。切开根瘤发现，根瘤内部为红色，判定供试菌株jyn6为具有固氮效率的根瘤菌(附图4)，且对其根瘤固氮酶活性进行测定，其值为4.65umol∙(g∙h)^-1。

由图6可知，与不接种根瘤菌的空白对照相比，圆叶决明闽育1号接种根瘤菌jyn6可极显著提高其植株鲜重、植株干重、株高、spad值和植株含氮量(p<0.001)。说明根瘤菌jyn6的结合性和固氮效率均较高。

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<110>福建农林大学

<120>一株决明属根瘤菌jyn6及其应用

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<213>根瘤菌jyn6的16srdna

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