基因GRMZM2G179981启动子在玉米苗期耐渍性筛选中的应用的制作方法

本发明属于农业和生物技术领域，具体涉及基因grmzm2g179981启动子在玉米苗期耐渍性筛选中的应用。

背景技术：

随着全球气候的改变，涝渍灾害在全球范围内发生的频率和强度越来越高(bailey-serresetal.,2012a)。尤其是最近十年，在亚洲、欧洲和非洲，涝渍事件发生的次数明显增加。在美国，过去12年里由于涝渍灾害造成的作物产量损失是仅次于干旱胁迫的，涝渍胁迫成为仅次于干旱的作物第二大非生物胁迫因子(bailey-serresetal.,2012b)。玉米是世界范围内种植范围最广的作物，其产量也受到各种非生物逆境胁迫因子的影响。在亚洲地区，涝渍灾害是限制玉米产量的重要非生物胁迫因子之一。仅在南亚和东南亚地区，超过18％的玉米种植面积频繁受到涝渍胁迫的影响(zaidietal.,2010)，每年由于涝渍灾害造成大约25％-30％的产量损失(sarkaretal.,1998)。我国玉米产区也易受涝渍灾害的影响，其中黄淮海地区的夏玉米和长江流域的春玉米受涝渍胁迫最为严重。黄淮海地区夏季降水量一般占全年的60％-70％，且降水时间相对集中于播种后的短时间内，因此苗期易受涝渍胁迫，进而影响玉米的生长发育和产量(余卫东2013)。在长江流域中下游地区，玉米苗期常遇低温春雨，花期易遇连绵梅雨，严重影响了南方玉米的高产和稳产。

玉米耐渍性相关性状主要表现为玉米在涝渍胁迫条件下能够提高其存活能力的适应性性状，如不定根和通气组织的形成(manoetal2006b)等。日本mano实验室在玉米耐渍性遗传定位中做出了很多工作：mano等(2005a，2005b)利用玉米自交系b64与大刍草杂交以及两个玉米自交系b64和na4杂交构建的f2分离群体将渍水胁迫下不定根形成相关的qtl共定位在第8染色体8.05bin上；利用两玉米自交系f1649和h84构建的f2群体将氧化还原土壤条件下耐渍性相关的qtl定位于第一染色体1.03-1.04bin(manoetal2006a)；利用玉米自交系与大刍草杂交的f2群体(manoetal2008；manoetal2007；manoetal2012)以及自交系mi29与大刍草杂交的高代回交群体(manoandomori2008)将控制通气组织形成的qtl定位于除第4和6染色体外的8条染色体上；利用玉米深根自交系b73与浅根系大刍草杂交构建f2分离群体，将控制根夹角相关的qtl定位于第2、4、7和10共4条染色体上(omoriandmano2007)；利用玉米自交系mi29和大刍草杂交，构建了以mi29为背景的45个导入系的群体，将耐渍性主效qtl定位于第4染色体4.07-4.08bin上，包含该qtl的导入系材料可直接用于玉米耐渍性遗传改良(manoandomori2013)。华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室玉米团队的qiu等(2007)利用耐渍性强玉米自交系hz32和耐渍性敏感自交系k12构建f2分离群体，在两个不同环境下将玉米苗期耐渍性相关的qtl定位于第4、7和9三个主要的qtl密集区域。osman等(2013)进一步调查了该群体渍水胁迫后动态表达的qtl，其中6个qtl在两个时期都有表达，7个est和microrna基因与动态定位qtl共定位于第1、4、6、7和9五条染色体上。zhang等(2013)利用144份玉米自交系的关联群体在第5、6和9三条染色体上共鉴定到4个显著关联的snp位点，其中一个snp位点正好位于高代回交群体定位的qtl区间内。印度zaidi等(2015)利用ril群体，将5个产量耐渍性qtl定位于第1、3、5、7和10共5条染色体上，共解释约30％的表型变异。

鉴于渍水胁迫后性状表型的复杂性，目前为止，科学研究者并没有克隆到玉米耐渍基因。因此，研究玉米苗期耐渍性的遗传机理，发掘苗期耐渍性优良等位基因，为玉米耐渍性的遗传改良提供基因资源和理论指导。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供了基因grmzm2g179981启动子在玉米苗期耐渍性筛选中的应用，所述的启动子序列为seqidno.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了针对基因grmzm2g179981启动子设计的引物在玉米苗期耐渍性筛选中的应用。

为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明通过分析了基因grmzm2g179981在玉米a3237和玉米a3239渍水处理后不同时间点表达模式的差异，结果表明该基因在耐性亲本玉米a3237中受到渍水胁迫后诱导上调表达。启动序列分析发现，该基因在启动子序列中存在34个snp和3个indels的差异(a3237中grmzm2g179981启动子序列为seqidno.1所示；a3239中grmzm2g179981启动子序列为seqidno.2所示)。通过对110份玉米自交系启动子区域进行重测序，发现13个变异位点与表型显著关联，这13个标记处于完全ld状态，且这13个多态性位点在a3237和a3239中均存在，表明这13个位点是grmzm2g179981控制苗期耐渍性的功能位点。grmzm2g179981启动子优良单倍型能够显著提高渍水胁迫后的存活率以及降低叶损伤程度，表明优良单倍型能够提高玉米苗期耐渍性。

因此seqidno.1所示序列或针对该序列设计的引物可用于玉米苗期耐渍性筛选；

以上所述的方案中，优选的，针对seqidno.1所示序列设计的引物为：f：gcggaacgaccgttgaaac，r：cttgtgctcctgatcagtgtg。

更进一步方案详见具体实施方式。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本申请通过对玉米a3237和a3239进行遗传多态性分析以及构建f2分离群体进行qtl定位，定位到一个新的耐渍性qtl位点。结合双亲差异蛋白质组分析，在qtl区段内鉴定到一个在a3237中特异性上调表达的基因。玉米耐渍性研究中首次将qtl定位结果和蛋白质组分析相结合筛选候选基因。表达水平分析也验证了该基因在a3237中特异上调表达，启动子序列分析也证实启动子序列在双亲之间有一定的差异，表达的差异通过启动子进行调节。

附图说明

图1为在玉米a3237和a3239中分析grmzm2g179981基因mrna丰度示意图；

取a3237和a3239二叶一心期渍水处理的根系分析各基因的表达水平，分别取处理前0h，处理后2h、4h和12h共4个时间点。

图2为基因grmzm2g179981启动子和5’-utr序列在a3237和a3239间差异示意图；

图中起始密码子(atg)标示为1。

图3为grmzm2g179981基因启动子区遗传变异分析示意图；

其中a表示多态性位点与表型rrdw和rttdw关联分析结果；b表示两两多态性位点间ld分析；c为不同单倍型hap^a3237和hap^a3239的基因型。

图4为不同单倍型hap^a3237和hap^a3239自交系间渍水胁迫后表型分析示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

grmzm2g179981基因表达分析

在温室种植玉米a3237和a3239(yuetal.,2015)，二叶一心期渍水处理，分别取处理前0h，处理后2h、4h和12h共4个时间点根系材料，提取rna，利用qrt-pcr技术分析grmzm2g179981的表达量，结果显示grmzm2g179981在耐渍性强亲本中诱导上调表达，而在敏感型亲本中诱导表达不明显(图1)。

实施例2：

grmzm2g179981基因启动子序列分析

利用引物aaccgctaaggtttccacgtc/gtgacgcaaaccaccttcc对grmzm2g179981基因1.5kb序列进行测序分析发现，在a3237和a3239中存在37个变异位点，包括34个snp和3个indels(图2)。

实施例3：

grmzm2g179981基因功能位点分析

利用以上引物，对110份玉米自交系启动子区域进行重测序，共发现61个多态性位点，包含图2中除了snp-1004外所有的多态性位点。通过候选基因关联分析发现，13个位点能够和表型(rrdw和rtdw)显著关联(图3中a)，并且这13个位点处于完全ld状态(图3中b)，自交系包含a3237基因型的单倍型(hap^a3237)与包含a3239基因型的单倍型(hap^a3239)相比较，具有显著较高的rrdw和rtdw，表明hap^a3237是优良的单倍型，亲本a3237中是一个耐渍性强等位基因(图3中c)。a3237中grmzm2g179981基因启动子序列为seqidno.1所示。a3239中grmzm2g179981基因启动子序列为seqidno.2所示。

grmzm2g179981重测序分析方法：

关联群体中随机选择了110份自交系进行重测序分析。根据b73参考基因组设计基因特异引物，扩增grmzm2g179981的1.5kb区段，通过pcr产物测序获得其在关联群体中不同自交系的序列。利用clcsequenceview软件将序列整理并进行多序列比对，利用tassel3.0软件将最小等位基因频率大于0.05的snp位点和indel抽提出来，随后利用tassel3.0软件，以q和k为协变量((lietal.,2013；wenetal.,2014))，采用cmlm模型，结合rrdw和rtdw表型数据进行候选区段的关联分析(yuetal.,2018)。

实施例4：

grmzm2g179981基因启动子在玉米耐渍性育种中的应用

针对grmzm2g179981基因启动子的变异区设计引物：f：gcggaacgaccgttgaaac，r：cttgtgctcctgatcagtgtg，对55份玉米自交系进行pcr扩增，共分为两种基因型，一种为a3237类型基因型(单倍型hap^a3237)，扩增片段大小为226bp(seqidno.3所示)，另一种为a3239类型基因型(单倍型hap^a3239)，扩增片段大小为220bp(seqidno.4所示)。将上述自交系进行渍水处理，调查渍水处理后存活率以及叶损伤，结果表明单倍型hap^a3237自交系均能够显著提高渍水胁迫后存活率表型以及能够降低渍水胁迫后的叶损伤程度(图4)，进一步证明了hap^a3237是优异的单倍型，并且扩增启动的引物能够用于筛选不同的单倍型材料，该标记可用于玉米苗期耐渍性遗传改良。

自交系表型鉴定方法：

为鉴定渍水处理后各自交系的存活率，于2014年5-9月，在华中农业大学温室(平均温度约为28℃)对关联群体进行了2次实验表型鉴定。盆栽试验按邱法展等(2007)描述的方法种植，苗期进行正常的水分管理。每份自交系种植3桶即3个生物学重复，每个桶淹水前间苗到10株。幼苗在2叶1心期(苗龄约7d)，开始淹水处理，水层保持2～3cm。为确保各次实验数据的相对一致性，存活率表型数据记录时以玉米自交系b73的存活率为参考，当b73的存活率为50％时，记录其它各自交系的存活率。存活率的计算是存活的株数除以总株数。叶损伤表型来源于以前发表的论文(yuetal.,2018)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>基因grmzm2g179981启动子在玉米苗期耐渍性筛选中的应用

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