本发明属于菌株培育技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株yb1701及其应用，具体为一种能够产acc脱氨酶、iaa生长素并对植物病原真菌具有广谱拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其用途，可拮抗16种常见植物病原真菌，并对水稻幼苗具有明显促生长作用的细菌。
背景技术：
碱蓬(suaedaglaucabunge)，又名碱蒿子、盐蒿子，多生于海滩、河谷、路旁、田间等盐碱地上，属于黎科碱蓬属，是一种耐盐性极强的盐生植物，在我国新、蒙、辽等省区分布广泛。目前碱蓬已成为生物改良盐渍土的首选植物品种。研究表明植物根系土壤中含有丰富的微生物，有助于植物吸收养分，促进植物生长。袁野(2018)从盘锦红海滩碱蓬根系土壤中利用纯培养方法分离得到80株嗜盐碱细菌。
解淀粉芽孢杆菌是一种具有广谱抑菌活性特点的细菌(吴一晶等，2012)，能够产生大量次生代谢产物和多种抑菌物质。邱思鑫等(2004)从烟草茎秆中分离出一株对丝状真菌具有很好抑制作用的内生解淀粉芽孢杆菌tb2；arrebola等(2009)从水果表面分离出对7种不同柑橘采后的真菌病原体具有抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌ppcb004；wong等(2010)从解淀粉芽孢杆菌nk10中分离出对多种病菌具有抑制活性的抑菌蛋白。章淑艳等(2017)分离出一株在麻山药根腐病防治中具有显著抑制效果的解淀粉芽孢杆菌，其抑菌率达到89.6％，显著高于施用化学药剂敌克松可湿性粉剂的处理。李社增等(2017)分离出一株防治番茄灰霉病的解淀粉芽抱杆菌，可以防治由灰葡萄孢菌引起的果实腐烂、叶、茎和花腐烂的疾病，可以使番茄增产。
微生物肥料在农业生产中具有重要作用，其中菌种是微生物肥料生产的应用基础。一方面微生物能够产生具有活性的、促进作物生长的代谢产物；另一方面，微生物能够拮抗植物病原菌，提高作物抗病性等。
技术实现要素：
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌菌株yb1701及其应用，具有广谱抑菌效果、能够产生产acc脱氨酶和iaa生长素的解淀粉芽孢杆菌，极具开发价值。
本发明是这样实现的，提供一种解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株，所述解淀粉芽孢杆菌菌株为yb1701，且所述解淀粉芽孢杆菌菌株yb1701保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16003。
提供一种菌剂，所述菌剂的活性成分为上述解淀粉芽孢杆菌yb1701或解淀粉芽孢杆菌yb1701的发酵液或解淀粉芽孢杆菌yb1701的代谢产物。
上述菌剂为下述任一一种菌剂：
1)抑制植物病原真菌的菌剂；
2)防治植物病原真菌病害的菌剂；
3)促进植物生长的菌剂；
4)提高植物抗逆性的菌剂；
5)降低植物对逆境敏感性的菌剂；
6)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(acc)的菌剂；
7)产生吲哚-3-乙酸(iaa)的菌剂；
所述逆境为干旱、高温、病虫害侵袭或重金属污染。
上述植物病原真菌为以下至少一种植物病原真菌：
1)玉米黑束病菌(acremoniumstrictum)；
2)玉米大斑病菌(exserohilumturcicum)；
3)瓜果腐霉病菌(pythiumaphanidermatum)；
4)玉米腐霉病菌(pythiumgramincolasubra)；
5)玉米圆斑病菌(bipolariszeicola)；
6)辣椒疫病菌(phytophthoracapsicileonian)；
7)番茄灰霉病菌(botrytiscinereapers.)；
8)苹果霉心病菌(trichotheciumroseum))；
9)稻瘟病菌(pyriculariagrisea)；
10)甜瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.melonis)；
11)高粱靶斑病菌(bipolarissorghicola)；
12)玉米弯孢叶斑病菌(curvularialunata)；
13)玉米穗腐病菌(fusariumgraminearum)；
14)黄色镰孢病菌(fusariumculmorum)；
15)玉米顶腐病菌(frumentumsubglutinans)；
16)向日葵核盘菌(sclerotiniasclerotorium)。
提供一种生物有机肥，所述生物有机肥的活性成分为权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌yb1701或解淀粉芽孢杆菌yb1701的发酵液或解淀粉芽孢杆菌yb1701的代谢产物。
提供一种上述解淀粉芽孢杆菌菌株的培养方法，包括将解淀粉芽孢杆菌yb1701在用于培养解淀粉芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
具体的，上述方法包括如下步骤：
1)取新鲜采集的根际带有土壤的碱蓬草，抖落其根基土壤，并称取10g根基土壤；
2)根基土壤风干后，将土壤样品置于带有玻璃珠并装有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中，室温120rpmin振荡30min，制成土壤悬液；
3)取1ml土壤悬液至装有9ml无菌生理盐水的试管中进行梯度稀释，分别取10-3，10-4，10-5稀释度0.1ml涂布至筛选培养基平板上，37℃培养24h，挑取单菌落进行分离纯化，得到解淀粉芽孢杆菌yb1701。
上述筛选培养基成分为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂粉18-20g，水1000ml，ph7.2-7.4，121℃灭菌20min。
具体的，解淀粉芽孢杆菌yb1701的发酵液的制备包括如下步骤：
1)将纯化培养的解淀粉芽孢杆菌yb1701由斜面接种至牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在37℃、180r/min下培养24h；
2)将步骤1)活化的菌株接入lb液体培养基中，于37℃、180r/min摇床中振荡培养48h，获得种子液；
3)将步骤2)所得的种子液按照5％接种量接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，于37℃180r/min摇床中振荡培养48h，获得解淀粉芽孢杆菌yb1701发酵液。
所述解淀粉芽孢杆菌yb1701的发酵液中解淀粉芽孢杆菌yb1701菌体含量为1.0×106～1.0×108cfu/ml。
本发明涉及的菌株保藏说明如下：
菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
拉丁名：bacillusamyloliquefaciens
菌株编号：cgmccno.16003
保藏机构：在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏机构简称：cgmc
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年6月25日
保藏中心登记入册编号：cgmccno.16003
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701是从碱蓬根际土壤中分离，该菌株可以产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)脱氨酶和iaa生长素，对供试16种植物病原真菌具有明显抑菌作用，在植物病菌病害生物防治方面和促生长方面有广阔的应用前景。
附图说明
图1解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的菌落(a)和单染色照片(b)；
图2解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的解淀粉透明圈照片；
图3解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的16srdna的pcr扩增电泳图；
图4基于16srdna构建的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701系统发育树；
图5解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701最适ph(a)和生长曲线图(b)；
图6解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701对水稻幼苗促生长照片；
图7解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701对供试植物病原菌的抑菌照片(每张图中先后分别为培养皿正反面照片)：(a)稻瘟病菌(b)玉米顶腐病菌(c)玉米圆斑病菌(d)辣椒疫病菌(e)番茄灰霉病菌(f)瓜果腐霉病菌(g)高粱靶斑病菌(h)黄色镰孢病菌(i)玉米穗腐病菌(g)玉米弯孢叶斑病菌(k)向日葵核盘菌(l)玉米大斑病菌(m)玉米腐霉病菌(n)玉米黑束病菌(o)苹果霉心病菌(p)甜瓜枯萎病菌。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实验中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂粉18-20g，水1000ml，ph7.2-7.4，121℃灭菌20min。
lb培养基：蛋白胨10g，nacl10g，酵母膏5g，蒸馏水1000ml，ph7.0，121℃灭菌20min。
无机盐培养基：mgso4.7h2o0.5g，cacl20.02g，kh2po41.0g，nh4no31.0g，fecl30.05g，蒸馏水1000ml，ph7.2，121℃灭菌20min。
df培养基：kh2po44g，na2hpo46g，mgso4·7h2o0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸钠2g，柠檬酸2g，(nh4)2so42g，组分1和组分2溶液各0.1ml(组分1:h3bo310mg，mnso4·h2o11.19mg，cuso4·5h2o78.22mg，moo310mg，znso4·7h2o124.6mg，溶于100ml灭菌蒸馏水中，-4℃保存；组分2:feso4·7h2o100mg溶于10ml灭菌蒸馏水中，-4℃保存)，蒸馏水1000ml，ph7.2。
adf培养基：以3mmol/lacc代替df中的(nh4)2so4，为唯一氮源。
淀粉基础培养基：淀粉2g、牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂粉18-20g，蒸馏水1000ml，ph7.2-7.4,121℃灭菌20min。
pda培养基：马铃薯200g，蔗糖(或葡萄糖)20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，ph自然，121℃灭菌30min。
hoagland营养液：取1.26ghoagland营养液(粉末)加入0.845g硝酸钙，定容至1000ml，115℃灭菌20min。
供试植物病原菌：玉米黑束病菌(acremoniumstrictum)；玉米大斑病菌(exserohilumturcicum)；玉米腐霉病菌(pythiumgramincolasubra)；玉米圆斑病菌(bipolariszeicola)；辣椒疫病菌(phytophthoracapsicileonian))；番茄灰霉病菌(botrytiscinereapers.)；苹果霉心病菌(trichotheciumroseum))；稻瘟病菌(pyriculariagrisea)；甜瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.melonis)；高粱靶斑病菌(bipolarissorghicola)；玉米弯孢叶斑病菌(curvularialunata)；玉米穗腐病菌(fusariumgraminearum)；黄色镰孢病菌(fusariumculmorum)；玉米顶腐病菌(frumentumsubglutinans)；向日葵核盘菌(sclerotiniasclerotorium)；瓜果腐霉病菌(pythiumaphanidermatum)。解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701对供试植物病原菌的抑菌照片见图7。
实施例1、本发明的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的分离与鉴定
1.菌株yb1701的分离
取新鲜采集的根际带有土壤的红海滩碱蓬草，抖落其根基土壤，称取10g，风干后将土壤样品置于带有玻璃珠并装有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中，室温120rpmin振荡30min，制成土壤悬液。取1ml土壤悬液至装有9ml无菌生理盐水的试管中进行梯度稀释，分别取10-3，10-4，10-5稀释度0.1ml涂布至筛选培养基平板上，37℃培养24h，挑取单菌落进行分离纯化。
2.菌株yb1701的鉴定
(1)形态学鉴定
对处于对数期且菌落形态大小稳定的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的单菌落进行形态描述，包括菌落的大小、颜色、透明程度、菌落表面形态(是否平坦、褶皱等)以及菌落边缘形态(整齐与否，是否规则等)。
在光学显微镜下观察经单染色、革兰氏染色以及芽孢染色后的解淀粉芽孢杆菌yb1701(处于对数生长期)的菌体形态、隶属于革兰氏阴性菌或者阳性菌，是否具芽孢。
结果表明，解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701菌落呈现乳白色，不透明，表面有褶皱，边缘不规则，易挑取；菌体呈现短小杆状，革兰氏阳性菌，且具有芽孢，菌体长为1.6-3.1μm，宽为0.9-1.1μm(见图1和图2)。
(2)生理生化特征分析
参考《伯杰细菌鉴定手册》(r.e.布坎南，n.e.吉木斯等编著，伯杰细菌鉴定手册，中国科学院微生物研究所翻译，科学出版社，1984)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999)测定上述解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的生理生化特征。
所述解淀粉芽孢杆菌yb1701的生理生化特征测定结果如表1所示：
表1解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的生理生化特征
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
3.16srdna序列同源性分析
采用菌落法提取菌株总dna用作基因扩增的模板，16srdna通用引物为27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'；1492r:5'-tacggttaccttgttacgactt-3',进行pcr扩增。反应体系为：2×mixtaq(购自takara公司)25ul，两种引物(10μm)各1μl，扩增模板2μl，用ddh2o补足体系到50μl。反应程序：95℃预变性需1min、95℃变性1min后、55℃退火1min、72℃延伸2min，然后35个循环，最后72℃再延伸10min，4℃保存。dna测序由上海生工完成，将所测得的碱基序列用ezbiocloud数据库进行同源性分析。
解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701菌株的16srdna的序列详见序列表中序列。解淀粉芽孢杆菌yb1701菌株的16srdna的琼脂糖凝胶电泳结果以及系统发育树见图3和图4。
4.解淀粉能力测定
取10ul处于对数生长期的上述步骤1分离纯化出的解淀粉芽孢杆菌yb1701菌悬液，三点式接种于含有淀粉的培养基中，培养2d后在平板中加入碘酊，10min后观察是否有透明圈出现。
结果表明，培养基上出现明显的透明圈(见图2)，证明上述步骤1分离纯化出的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701具有很强的解淀粉能力。
5.生长特性分析
采用牛肉膏蛋白胨液体培养基为基础培养基，将其ph设置为4、5、6、7、8、9、10、11，每组设置3次重复。按照1％接种量接种于培养基中，37℃180rpmin摇床培养24h，取样利用nanodrop2000微量分光光度计进行od值测定，以od600为纵坐标，不同ph为横坐标，绘制折线图如图5a。
结果表明上述分离纯化的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701菌株的最适ph为ph7.0-8.0。
实施例2、本发明的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的生长曲线绘制
以常规牛肉膏蛋白胨细菌培养基内含物为底物，按照1％接种量，在ph7.5、生理盐度(nacl)1％的条件下，37℃180rpmin摇床培养，取样间隔为2h取一次样，进行od600测定，每组设置3组平行。取样利用nanodrop2000微量分光光度计进行od值测定，以od600数值为从坐标，培养时间为横坐标，绘制菌体生长曲线如图5b。
实施例3、本发明的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的培养基优化
采用无机盐培养基为基础培养基，分别用1％的蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉以及牛肉膏作为唯一碳源，和分别用1％的蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵以及硝酸钾作为唯一氮源，确定最佳碳源和氮源。根据单因子试验筛选出的最佳碳源和氮源，以及磷酸二氢钾的浓度和ph的最佳范围为变异因素，采用正交试验进行培养基优化，确定培养基各组分的最佳配比。
表2正交试验培养基优化
结果表明，麦芽糖为最适碳源，用量为0.3％，酵母浸粉为最适氮源，用量为1.5％，牛肉膏为1％，磷酸二氢钾为0.5％，最佳ph为7.5。影响解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701菌株生长的因素大小排序为：酵母浸粉>麦芽糖>牛肉膏>ph>磷酸二氢钾。
实施例4、本发明的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701产iaa能力和脱氨酶活性测定
1.产iaa能力测定
采用比色法测定本实施例1所得到的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701菌株产iaa的能力，将菌株接种在df培养基中过夜生长，然后转移到含0.1％l-色氨酸的df培养基中。菌株在28℃条件下培养7d，然后8000rpm离心10min。将1ml悬浮液混合于2mlfe-h2so4溶液(1ml0.5mfecl3·6h2o加入到75ml6.13mh2so4)中，黑暗放置45min。测量样品在450nm的吸光度，根据标准曲线求出iaa的浓度。
结果显示：实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的iaa活性为137.58μg/ml。因此所述的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701具有产iaa能力。
2.acc脱氨酶活性测定
将实施例1所得到的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701接入5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃培养24h。吸取0.5ml菌液至60ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，同等条件扩培36h，在4℃8000rpm条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。用15ml不加(nh4)2so4的df液体培养基洗涤两次，重悬于24mlacc终浓度为3mm的adf培养基中，置于28℃培养24h，诱导产生acc脱氨酶。收集菌体后，用20ml0.1mph7.6的tris-hcl缓冲液离心洗涤两次，将菌体平均分到三个ep管中，-20℃贮存。将贮存菌体重悬于1ml0.1mph7.6的tris-hcl缓冲液中，于10000rpm离心5min，弃上清液，迅速振荡，破碎细胞。取100μl粗酶液4℃贮存，用于测定蛋白浓度；其余粗酶液立即测定acc脱氨酶活性。取200μl粗酶液至1.5ml的ep中，加入33.4μl0.3m的acc混匀，30℃水浴15min，加入1ml0.56m的hcl终止反应。对照：(1)不加粗酶液；(2)不加acc。10000rpm离心5min，吸取1ml上清液至试管中，加入800μl0.56m的hcl和300μl0.2％的2,4-二硝基苯肼溶液，30℃保温30min，加入2ml2m的naoh溶液混匀。以蒸馏水替代上清液，其它步骤相同，用于分光光度计调零，测定540nm处的吸光度值，根据α-酮丁酸标准曲线计算出α-酮丁酸的含量。取适量粗酶液加入试管中，再加pbs缓冲液补足至75μl，加入2ml考马斯亮蓝溶液，混合震荡后，显色5min，测定595nm处的吸光度值，根据牛血清白蛋白标准曲线计算出菌体的蛋白含量。acc脱氨酶活力(μmol·mg-1·h-1)＝α-酮丁酸含量(μmol)/蛋白含量(mg)/反应时间(h)。蛋白质测定采用比色法，以牛血清白蛋白作为底物。测定结果为3次平均值。
结果显示：实施例1所述的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701的acc脱氨酶活性为3.03μmol·mg-1·h-1。因此所述的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701具有acc脱氨酶活性，进而可以提高植物抗旱、抗高温、病虫害侵袭或重金属污染等逆境能力。
实施例5、本发明的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701对植物病原真菌的抑菌率测定
采用三点对峙法对实施例1所得到的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701进行拮抗病原真菌抑菌率测定，具体操作如下：在pda平板上分别在三点(呈正三角形)接种植物病原真菌的菌饼，在中间位置接种解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciensstraing81)yb1701的发酵液的滤纸片，每组3次重复，置28℃的恒温箱中培养4-5d，测得各处理菌落的直径，求出平均值并计算抑菌率(％)。
抑菌率％＝(病原菌心与心的距离(d)-[供试菌株心与病原菌心的距离(d)-供试菌株心与病原菌垂直距离(r)])/病原菌心与心的距离(d)*100％
结果表明解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701菌株的发酵液对供试16种植物病原真菌中的玉米黑束病菌、苹果霉心病菌、玉米腐霉病菌、玉米圆斑病菌、辣椒疫病菌、番茄灰霉、苹果霉心病菌、稻瘟病菌、甜瓜枯萎病菌、高粱靶斑、玉米弯孢叶斑、玉米穗腐病菌、黄色镰孢、玉米顶腐病菌、向日葵核盘菌、瓜果腐霉病菌，抑菌率≥50％；特别是对供试的玉米大斑病菌和向日葵核盘菌，抑菌率≥80％(见表3)。
表3解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701发酵液拮抗病原真菌抑菌率
实施例6、本发明的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701对水稻幼苗的促生长实验
分别选择大小相近并且籽粒饱满的水稻种子，28℃下浸泡24h，然后30℃下催芽24h，将发芽的种子播种于装有hogland营养液并且覆盖纱网的750ml的塑料杯上，每组3次重复。置于光照培养箱昼夜温度28℃/22℃，光周期为12h/12h，空气相对湿度为80％，光照强度为300μm/(m2.s2)中培养。待苗长至2叶一心期时进行处理，加入3％的对数期的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701发酵液。以加3％的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。处理后第10d和第16d测量苗高、根长、幼苗和根干重，结果见表4和图6。
表4解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701发酵液对水稻幼苗的影响
结果表明经解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701发酵液处理的水稻幼苗生长得到促进，除根长和幼苗干重在第10d与对照相比差异不显著外，其余的苗高、根长、苗干重和鲜重在第10d和第16d均显著增加。说明本实施例1所得的解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)yb1701对水稻幼苗的生长有显著地促进作用。
序列表
<110>沈阳师范大学
<120>一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
<130>2019
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1012
<212>dna
<213>解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)
<400>1
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