毛竹PheHDZ45蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种毛竹phehdz45蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

毛竹(phyllostachysedulis)是禾本科刚竹属多年生常绿植物，为全国最主要竹种，中国被称为毛竹的“故乡”。毛竹是我国栽植面积最大、分布范围最广、生长最快、应用最广泛的经济竹种。竹叶可造纸、竹笋可食用，竹竿可作为建筑、家具、农具以及工艺品用材等。

hd-zip蛋白，即同源异型域一亮氨酸拉链蛋白，是同时含有homeodomain(同源异型域：hd)和leucinezipperdomain(亮氨酸拉链域：lz)结构域的一类转录因子，是目前发现的含有hd结构域的数量最大的转录因子基因家族。这类转录因子只存在于高等植物中，在其他生物体中(动物和真菌)均没有发现。hd-zip转录因子具有调节植物发育进程，调控植物对外界环境胁迫反应的作用，是近年来植物抗逆相关基因研究的热点。

毛竹(phyllostachysedulis)是禾本科刚竹属多年生常绿植物，为全国最主要竹种，中国被称为毛竹的“故乡”。毛竹是我国栽植面积最大、分布范围最广、生长最快、应用最广泛的经济竹种。竹叶可造纸、竹笋可食用，竹竿可作为建筑、家具、农具以及工艺品用材等。毛竹在整个生长发育期对水分需求量很大，干旱能够导致叶片早衰、竹竿枯萎等现象，在生殖生长期尤其在出笋期的毛竹受干旱胁迫时，则会造成竹笋的出土缓慢，产量减少，即便出土也容易干死，导致残次竹的增多。因此，培育出一批耐旱的毛竹新种质，对提高毛竹的产量，促进林产业稳定发展，增加国民的经济收入具有重要的意义。

目前已公布的hd-zip基因及其同源基因，多来源于模式植物或者草本植物，这些植物多为一年生植物，而在毛竹中关于hd-zip基因的功能还尚未报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗旱性高的毛竹phehdz45蛋白及其编码基因与应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种毛竹phehdz45蛋白，所述的毛竹phehdz45蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明的一种编码所述的毛竹phehdz45蛋白的基因序列，所述的毛竹phehdz45蛋白的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的含有所述的编码基因序列的载体。

本发明的所述载体的构建方法，包括如下步骤:将两端包含酶切位点的毛竹phehdz45蛋白编码基因序列构建到peasyt1simplecloningvector载体上，转入大肠杆菌感受态细胞transt1内，得到t1-phehdz45重组质粒，双酶切t1-phehdz45重组质粒和pcambia1301a质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pcambia1301a-phehdz45。

本发明的含有所述载体的工程菌。

本发明的用于克隆所述编码基因序列的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列如seqidno.5所示。

seqidno.4：phehdz45-f：5’-cgggatccagcacgcactcctcaagca-3’；

seqidno.5：phehdz45-r：5’-gcgtcgaccggcattatcgccgtacttc-3’。

本发明的一种毛竹phehdz45基因，所述的毛竹phehdz45基因的cdna全长的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明的所述的毛竹phehdz45基因在改造植物抗旱中的应用。

进一步地，通过农杆菌介导的愈伤组织法将所述基因或所述的编码基因序列转入植物中。

有益效果：本发明首次提供了毛竹抗旱相关的phehdz45蛋白及其编码基因与应用。通过农杆菌介导的愈伤组织浸染法将phehdz45基因表达载体转入野生型水稻中化11中，结果显示无论在萌发期还是在苗期转基因水稻的抗旱性得到了明显的提高，说明phehdz45基因能够提高转基因水稻的抗旱性。利用毛竹phehdz45基因表达载体获得的植物材料，对外界干旱环境具有一定的适应性，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是本发明所述phehdz45基因所编码的蛋白的氨基酸序列和结构域划分图。

图2是本发明实施例2毛竹phehdz45基因的诱导表达分析。

图3本发明实施例4pehdz45基因pcr扩增电泳图。m：trans2kdnamarker；lane1-2：pehdz45基因。

图4是本发明实施例5转基因水稻和野生型水稻在干旱条件下的萌发表型图。a：不同的水稻株系在干旱条件下萌发的10d时的长势；b：不同的水稻株系在干旱条件下萌发的10d时的株高统计。wt：野生型水稻；l4、l5、l6：转基因过表达株系。

图5是本发明实施例5转基因水稻和野生型水稻在干旱前后的表型图。a：不同的水稻株系在干旱前后的表型图；b：不同的水稻株系在干旱处理20d后的相对含水量；c：不同的水稻株系在干旱处理20d后的存活率。wt：野生型水稻；l4、l5、l6：转基因过表达株系。

具体实施方式

通过解释以下本申请的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。

本发明的一种毛竹phehdz45蛋白，所述的毛竹phehdz45蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明的一种编码所述的毛竹phehdz45蛋白的基因序列，所述的毛竹phehdz45蛋白的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的含有所述的编码基因序列的载体。

本发明的所述载体的构建方法，包括如下步骤:将两端包含酶切位点的毛竹phehdz45蛋白编码基因序列构建到peasyt1simplecloningvector载体上，转入大肠杆菌感受态细胞transt1内，得到t1-phehdz45重组质粒，双酶切t1-phehdz45重组质粒和pcambia1301a质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pcambia1301a-phehdz45。

本发明的含有所述载体的工程菌。

本发明的用于克隆所述编码基因序列的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明的一种毛竹phehdz45基因，所述的毛竹phehdz45基因的cdna全长的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明的所述的毛竹phehdz45基因在改造植物抗旱中的应用。

通过农杆菌介导的愈伤组织法将所述基因或所述的编码基因序列转入植物中。

实施例1

一个毛竹phehdz45基因编码的蛋白序列

使用primers软件，对毛竹phehdz45基因的cdna序列全长，进行蛋白序列翻译(seqidno.1)，并根据hd-zip基因特点，毛竹phehdz45蛋白序列进行homeodomin(hd)和leucinezipper(zip)结构域的划分(图1)。

实施例2

毛竹耐旱候选基因phehdz45诱导表达模式分析

1.毛竹叶片totalrna的提取：

将生长在温度(白/黑)为25℃/18℃，光周期(光/暗)为18/6h的温室中月三个月大小，且长势良好的毛竹种苗，进行自然干旱(脱水处理)和模拟干旱(25％peg-6000溶液喷洒叶片)处理，在处理前取适量未处理叶片做对照，处理后不同时间段分别取样(1h、3h、6h、12h和24h)，放入试管中，立即放入液氮中快速冷冻，放入-80℃超低温冰箱中备用。

2.引物设计：

根据毛竹phehdz45基因的cdna序列全长，利用primer3plus软件设计荧光定量试验的引物：

f：5’-agcacgcactcctcaagca-3’；

r：5’-cggcattatcgccgtacttc-3’。

用pcr对其特异性进行检测，在确保pcr特异性扩增前提下，方可使用。以毛竹tip41基因为荧光定量试验的阳性对照，tip41基因的引物为：

f：5’-aaaatcattgtaggccattgtcg-3’；

r：5-actaaattaagccagcgggagtg-3’。

3.荧光定量pcr：

荧光定量pcr反应体系如下：

pcr反应参数如下：

反应结束后，对产物进行加热，获得产物的溶解曲线。采用2^–δδct法对获得的信号和数据进行处理(图2)。

实施例3

毛竹抗旱相关基因phehdz45的克隆

根据毛竹基因组网站上公布的phehdz45基因cds序列，设计pcr扩增该片段的引物。

引物序列如下：

phehdz45-f：5’-cgggatccagcacgcactcctcaagca-3’；

phehdz45-r:5’-gcgtcgaccggcattatcgccgtacttc-3’。

以毛竹叶片totalrna反转录第1链cdna为模板，用上游引物和下游引物进行pcr扩增，pcr反应体系如表1所示：

表1

pcr反应条件为：预变性：98℃10min；变性：98℃10s；退火：62℃5s；延伸：72℃30s，33个循环；总延伸：72℃10min。

反应结束后，吸取pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳(图3)，在凝胶成像系统中检测和切胶后，使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收，将dna回收结果进行测序。

实施例4

毛竹phehdz45基因的过表达载体的构建

将测序正确的目的基因片段phehdz45与1301a载体片段，用t4dna连接酶进行连接，25℃连接2～12h，连接体系如表2所示：

表2

取5～10μl的构建好的载体pcambia1301a-phehdz45质粒轻轻导入100μleha105农杆菌感受态细胞中，进行农杆菌的转化。

实施例5

将植物过表达载体pcambia1301a–phehdz45转入野生型水稻中化11中

(1)诱导：将成熟饱满的水稻种子剥去稻壳后，倒入75％的酒精，摇晃清洗5min，进行表面消毒。洗完后将水稻种子转入含有滤纸的培养皿中，晾干。将种子逐一挑入诱导培养基中。28℃全光培养15d左右，长出黄色愈伤组织。

(2)侵染：将愈伤组织挑入干净的空瓶内，倒入已制备好的农杆菌菌液，洗两次，每次15min，洗完后，将愈伤倒入含有滤纸的培养皿中晾干。22℃暗培48h以上。

(2)选择：将暗培过的愈伤组织，先用无菌水反复清洗，每次大概3min左右，直至将残余的菌液洗干净为止，之后羧苄水进行清洗，洗两次，每次15min，倒入含有滤纸的培养皿中，晾干。再移入含有潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃全光培养20d左右。

(3)分化：将上述选择出的抗性愈伤挑入分化培养基中，28℃全光培养。

(4)生根：将分化出来的水稻幼苗移入生根瓶中，待幼苗长至与瓶口齐平时，拿去封口膜，倒入4cm左右高的无菌水，进行炼苗，期间需要换水，5d之后移入大田中。

实施例6

毛竹phehdz4基因的转基因水稻筛选和耐旱性表型鉴定

1.组织化学染色：

将不同株系的水稻幼苗叶片剪成0.5-1.0cm长度，浸泡于gus染色液中，于37℃水浴锅中染色12h，用75％的乙醇脱色去除叶绿素，然后进行观察。

2.pcr分子验证：

首先根据ctab法进提取phehdz45转基因水稻叶片的dna，

(1)在水浴锅(60℃)内溶解ctab提取缓冲液；

(2)将叶片置于研钵内，倒入液氮，研磨至粉状。分装入2mldof管中，每管加入1mlctab提取缓冲液，漩涡震荡30s，置于冰上静3-5min，使充分裂解；

(3)将dof管置于水浴锅(65℃)中，保温1h，使细胞完全破碎；

(4)向dof管中加入1ml酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，并充分混匀，1.3×10⁴rpm，离心15min，取上层水相至新的dof管中，加入等体积的氯仿异戊醇，充分混匀，再次1.3×10⁴rpm，离心15min；

(5)再次吸400ml的上清液至新的dof管中，加入400ml的异丙醇，混匀，于-20℃冰箱中静置半小时，1.3×10⁴rpm，离心15min，去上清；

(6)加入1ml的乙醇(70％)，离心6min，弃上清；

(7)重复步骤(6)；

(8)加50μl灭过菌的纯水溶解沉淀，并进行dna的纯度、浓度及a260/a280值的检测。

以野生型水稻dna作为对照，使用目的基因过表达载体的引物，对转基因水稻的植株dna进行pcr筛选。

3.毛竹phehdz45基因的转基因水稻的抗旱表型分析

将相同数量，且活力相似的转基因野生型水稻和转基因水稻种子，在不同浓度的peg溶液下进行萌发实验，10d后，对种子的萌发的长势进行拍照，并对不同株系的水稻种苗的株高进行统计(图4)。

将转基因野生型水稻和转基因水稻种子，种植于温室中，长至5五叶期，拍照观察表型；同时进行干旱处理，干旱过程中，拍照观察表型变化。并对不同株系的水稻干旱处理后相对含水量和存活率进行统计(图5)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>毛竹phehdz45蛋白及其编码基因与应用

<130>2019

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>231

<212>prt

<213>人工序列(phehdz45)

<400>1

metgluglygluglugluglyglutrpmetmetaspvalproglygly

151015

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210215220

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225230

<210>2

<211>696

<212>dna

<213>人工序列(phehdz45-cds)

<400>2

atggagggcgaggaggagggggagtggatgatggacgtgccggggggcaaggacaggaag60

ggcgtggacaggaagaagcggttcagcgaggagcagatcaagtcgctcgagtccatgttc120

gcgacgcagaccaagctggagccgcggcagaagctgcagctggcgcgggagctcggcctg180

cagccgcgccaggtcgccatctggttccagaacaagcgcgcgcgctggaagtccaagcag240

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caggagccgcaggggaagtacggcgataatgccgacggcggtggcgccggggacgacgtg420

cactccggcgtcgccggcatgaaggaggagctcgtcgatgccggggccgctctttactcg480

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cggccatcgtcgcagccggcgcacgccgcctcgggcatcacggcttcggggccggcggag600

caccaatcgtcgttccagttccactcgagctggccgtcgcccgcggagcagacctgcagc660

agctcgcaatggtgggaattcgagcccttgagctag696

<210>3

<211>2111

<212>dna

<213>人工序列(phehdz45-cdna)

<400>3

cgccgcacgcgctggctctggctggagagagggatagggatcagaggccgctgcgtgctc60

cgaattctctgcctctgccccacgacagcgaccccgaagaggcaggcggggccgcgcgga120

acaacgcagctagcgagagagagagagagagactacgcatgcacgccaccgcgctccatt180

ggccaacccgttgccatcgcgccgattaaataactagctaggcgagcaagctagctgcgg240

cgctaccctgcgatccattcctccccttcttccacctccaacgagccaggtgcatgccca300

ggtgagagtttgagtcgacacgcgcggcgccagagtgagcgagctggtgatcatggaggg360

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ccaggtcgccatctggttccagaacaagcgcgcgcgctggaagtccaagcagctcgagcg600

cgagtactcggtgcttcgcgacgactacgacgccctcctctgcagctacgagtccctgaa660

gaaggagaagcacgcactcctcaagcaagtatgtgtctccgtcgatcacgataccgtgtt720

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gccgctctttactcggtcgagggtggcggcggcaagctctcccacttaggcgacgacgac960

gcgggcctcttcctccggccatcgtcgcagccggcgcacgccgcctcgggcatcacggct1020

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cccaacggtgtgccacctggtctccatccacggttgagtgggtgagtcctttgcgtggat1800

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gtctcaacatgttgaatcgtcagctatcattatactcagcaacgtaaactnnnnnnnnnn1920

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ggtgggaagtactgacgaccgttaactctaattttttaaaagtagagattttagatattt2040

gaacccatgacacgtggactatgaaacattagttaatcacattatccaaatatcgccgct2100

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<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(上游引物)

<400>4

cgggatccagcacgcactcctcaagca27

<210>5

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(下游引物)

<400>5

gcgtcgaccggcattatcgccgtacttc28