检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用与流程

本发明属于水稻育种
技术领域：
，具体涉及检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术：
：水稻是我国最重要的粮食作物，在我国粮食生产和国民经济建设中占有十分重要的地位。长期以来，我国一直重视提高水稻单位面积的产量，并取得了举世瞩目的成就。自1995年起，我国水稻单产稳定在6t/ha以上，跨入了世界先进行列。但进入1990年以后，水稻单产的增长速度滞缓。为了进一步提高产量潜力，我国于1996年启动了以理想株型与亚种间杂种优势相结合为技术路线的超级杂交稻育种计划，目前已育成80余个超级稻品种。这些品种产量高，兼顾品质与抗性，在试验示范区或特定气候条件下产量可达到12～21t/ha，展示了超级稻的巨大增产潜力，这为稳定和保证我国的水稻生产起到了十分重要的作用。水肥(尤其是氮肥)投入量大，水肥资源利用效率低是我国目前水稻生产中的一个突出问题。据统计，我国目前水稻平均氮肥施用量为180kg/ha，高出世界水稻氮肥平均施用量的75％。在江苏省的部分县(市)，水稻氮肥平均施用量超过300kg/ha，少数田块甚至高达350kg/ha。氮肥的过量施用造成了氮素利用率大幅度下降。我国水稻氮肥吸收利用率(re，施肥区作物氮素积累量与氮空白区作物氮素积累量的差占施氮总量的百分数)仅为30～35％，比发达国家低15～20个百分点。在江苏、浙江等高氮投入区，re甚至不到20％。在较好的营养及作物管理条件下，水稻氮肥的农学利用率(ae，施用单位氮素所能增加的稻谷产量)可以达到20kg稻谷/kgn以上。但在我国，水稻的ae已由1958～1963年的15～20kg稻谷/kgn下降到1981～1983年的9.1kg稻谷/kgn。近年来，随着氮肥投入量的增大，ae仍在进一步下降。氮肥的过量施用还会造成水稻倒伏、病虫害发生严重和稻米品质变劣，同时也会造成严重的环境污染。水稻氮素利用效率的研究不仅具有重大的理论价值，也是生产实践中面临的重大科学问题。nrt1.1b是水稻肽转运蛋白家族成员，对水稻硝酸盐的吸收和转运起着重要作用。该基因在籼粳稻间一个碱基的变异(a/g)，导致相应氨基酸的改变(籼稻为甲硫氨酸，粳稻为苏氨酸)，从而导致籼粳稻硝酸盐吸收利用的差异。hu等(2015)通过图位克隆方法从籼稻ir24中克隆了硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b，利用标记辅助选择技术将籼型nrt1.1b基因导入到粳稻，可提高粳稻的氮肥利用率，并获得较高的产量，在改良粳稻的氮肥利用率和提高产量方面具有重大的利用价值，但是目前并没有一种高效准确检测nrt1.1b基因的kasp标记。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用，利用所述引物组、试剂盒及其检测方法能够准确地鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因型，显著提高氮高效种质资源的鉴定准确性和检测效率，操作简便，减少了氮素利用率测定的规模和频率，降低了研发成本，缩短了育种进程，提高了育种效率。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的引物组，所述引物组包括：核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物和核苷酸序列如seqidno.3所示的通用引物。本发明还提供了一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1所述引物组，还包括：2×kaspmastermix。本发明还提供了一种硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的kasp标记检测方法，包括以下步骤:(1)提取待测样品和对照样品的全基因组dna，以所述全基因组dna为模板，利用权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂盒进行kasp反应，得kasp反应产物；(2)对所述kasp反应产物进行扫描，根据荧光颜色判断待测样品的基因型，若待测样品产物荧光显示颜色与阳性对照相同，则待测水稻品种携带籼型nrt1.1b基因；若待测样品产物荧光显示颜色与阴性对照相同，则待测水稻品种含有粳型nrt1.1b基因；若待测样品产物荧光显示颜色为绿色，则待测样品基因型为杂合型nrt1.1b/nrt1.1b。优选的，步骤(1)所述kasp反应的体系以5.07μl计为：2.5μl模板dna，2×kaspmastermix2.5μl、引物混合液0.07μl。优选的，所述kasp反应的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，自61℃开始退火并延伸进行10个循环，每个循环退火并延伸的温度降低0.6℃，每个循环退火并延伸的时间为60s；94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒或所述kasp标记检测方法在水稻种质资源鉴定中的应用。本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒或所述kasp标记检测方法在水稻育种中的应用。本发明提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的引物组，所述引物组包括：核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物和核苷酸序列如seqidno.3所示的通用引物。利用本发明所述引物组可筛选出检测水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的特异snp位点，能够准确地鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b，显著提高氮高效种质资源的鉴定准确性和检测效率。在本发明实施例中，应用所述引物组的检测方法准确可靠，操作简便，减少了氮素利用率测定的规模和频率，降低了研发成本，缩短了育种进程，提高了育种效率。在分子辅助育种领域，为氮高效种质资源的创制和水稻氮高效新品种的培育提供了技术支撑。附图说明图1为水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的kasp标记分型图。具体实施方式本发明提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的引物组，其特征在于，所述引物组包括：核苷酸序列如seqidno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seqidno.2所示的反向引物和核苷酸序列如seqidno.3所示的通用引物。在本发明中，所述正向引物为primer_allele，核苷酸序列如seqidno.1所示：cagcctccacttgctcgcca；反向引物为primer_alleley，核苷酸序列如seqidno.2所示：agcctccacttgctcgccg；通用引物为primer_common，核苷酸序列如seqidno.3所示：gacaggtcggcggcggagt。本发明还提供了一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的试剂盒，所述试剂盒中包含所述引物组，还包括：2×kaspmastermix。本发明所述试剂盒中，所述引物组以引物组混合液的形式存在，以72×assaymix表示。所述72×assaymix可针对snp位点扩增出特异的荧光序列。本发明还提供了一种硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的kasp标记检测方法，包括以下步骤:(1)提取待测样品和对照样品的全基因组dna，以所述全基因组dna为模板，利用权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂盒进行kasp反应，得kasp反应产物；(2)对所述kasp反应产物进行扫描，根据荧光颜色判断待测样品的基因型，若待测样品产物荧光显示颜色与阳性对照相同，则待测水稻品种携带籼型nrt1.1b基因；若待测样品产物荧光显示颜色与阴性对照相同，则待测水稻品种含有粳型nrt1.1b基因；若待测样品产物荧光显示颜色为绿色，则待测样品基因型为杂合型nrt1.1b/nrt1.1b。在本发明所述检测方法中，提取待测样品和对照样品的全基因组dna，以所述全基因组dna为模板，利用所述引物组或所述试剂盒进行kasp反应，得kasp反应产物；所述对照样品以扬稻6号为阳性对照，以淮稻5号为阴性对照。本发明所述全基因组dna的提取方法优选为ctab法，提取得到所述全基因组dna后，优选还包括稀释，所述稀释优选为稀释至15～25ng/μl。在本发明中，所述kasp反应的体系以5.07μl计，优选为：2.5μl模板dna，2×kaspmastermix2.5μl、72×assaymix0.07μl。所述kasp反应的程序优选为：94℃预变性15min；94℃变性20s，自61℃开始退火并延伸进行10个循环，每个循环退火并延伸的温度降低0.6℃，每个循环退火并延伸的时间为60s；94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。得kasp反应产物后，本发明对所述kasp反应产物进行扫描，若待测样品产物荧光显示颜色与阳性对照相同，则待测水稻品种携带籼型nrt1.1b基因；若待测样品产物荧光显示颜色与阴性对照相同，则待测水稻品种含有粳型nrt1.1b基因。本发明优选利用pherastarfs多功能酶标仪对所述反应产物进行扫描，所述pherastarfs多功能酶标仪优选购自lgc公司,货号为kbs-0021-001。在本发明中，所述pherastar扫描仪可读取荧光数据，荧光扫描的结果会自动转化成图形，其中阳性对照、阴性对照会显示不同的荧光颜色。若待测样品产物荧光显示颜色与阳性对照相同，则待测水稻品种携带籼型nrt1.1b基因(a:a)；若待测样品产物荧光显示颜色与阴性对照相同，则待测水稻品种含有粳型nrt1.1b基因(g:g)；若待测样品产物荧光显示颜色为绿色，则待测样品基因型为杂合型nrt1.1b/nrt1.1b(a:g)。本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒或所述kasp标记检测方法在水稻种质资源鉴定中的应用。本发明所述水稻种质资源鉴定的方法优选与上述检测方法相同，在此不再赘述。本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒或所述kasp标记检测方法在水稻育种中的应用。本发明所述水稻育种优选为分子标记辅助育种，所述分子标记辅助育种的方法优选与上述检测方法相同，在此不再赘述。下面结合实施例对本发明提供的检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1s1提取dna以扬稻6号为阳性对照、以淮稻5号为阴性对照，分别提取对照品种和22个扬稻6号与淮稻5号杂交后代品系的全基因组dna(浓度约15-25ng/μl)；s2配制kasp扩增反应体系在微孔反应板的样品孔中按顺序加入2.5μldna样品，后加入kasp反应试剂，反应体系见表1。dna样品顺序为：a1～p1及a2～f2按顺序加入1～22个待测样品dna，g2孔加入阳性对照扬稻6号dna，h2加入阴性对照淮稻5号dna，i2和j2孔为空白对照。表1kasp检测的反应体系体积(μl)dna2.52×kaspmastermix2.572×assaymix0.07总体积5.07s3kasp扩增反应pcr扩增在水浴热循环仪中完成，touchdownpcr反应条件为:94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃-55℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。s4pcr扩增产物荧光显色待pcr反应完成后，利用pherastar扫描仪对反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。根据荧光扫描的结果判断待测样品的基因型，若待测样品产物荧光显示颜色与阳性对照相同，则待测水稻品种携带籼型nrt1.1b基因(a:a)；若待测样品产物荧光显示颜色与阴性对照相同，则待测水稻品种含有粳型nrt1.1b基因(g:g)；若待测样品产物荧光显示颜色为绿色，则待测样品基因型为杂合型nrt1.1b/nrt1.1b(a:g)。标记分型结果如图1所示：检测结果显示，阳性对照为蓝色，阴性对照为红色；i1和b2为蓝色，与阳性对照相同，表明基因型为籼型nrt1.1b；a1、b1、e1、l1、n1、p1、e2为红色，与阴性对照相同，表明此7个样品的基因型为粳型nrt1.1b；c1、d1、f1、g1、h1、j1、k1、m1、o1、a2、c2、d2、f2为绿色，表明此13个样品的基因型为籼粳杂合型nrt1.1b/nrt1.1b。本发明提供了检测水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的引物组、试剂盒及其检测方法和应用，可筛选出检测水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的特异snp位点，能够准确地鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b，显著提高氮高效种质资源的鉴定准确性和检测效率。且检测方法准确可靠，操作简便，减少了氮素利用率测定的规模和频率，降低了研发成本，缩短了育种进程，提高了育种效率。在分子辅助育种领域，为氮高效种质资源的创制和水稻氮高效新品种的培育提供了技术支撑。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所<120>检测水稻硝酸盐转运蛋白基因的引物组、试剂盒及其检测方法和应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cagcctccacttgctcgcca20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agcctccacttgctcgccg19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gacaggtcggcggcggagt19当前第1页12