本发明涉及一种梅花鹿微卫星位点m027的特异性扩增引物及其应用。
背景技术：
梅花鹿鹿茸作为一种传统名贵的医疗保健药材，具有很高的经济价值。当前影响我国梅花鹿养殖业经济效益的关键问题是提高产茸量。但鹿茸高产性状受多基因控制，是遗传力很低的数量性状。运用传统育种技术，周期比较长，如双阳梅花鹿的选育长达50年，且难以进行早期选择。因此，目前许多学者利用分子遗传标记方法从分子水平对梅花鹿鹿茸的生产性状进行研究，分子遗传标记有效克服传统方法的缺点，可以筛选到对鹿茸起直接或间接作用的功能基因，有助于改良梅花鹿的品种，提高梅花鹿产茸量。
迄今为止，在梅花鹿中已经发现有200多个ssr位点，主要应用到遗传多样性、遗传结构分析、种群基因渗入检测等方面的研究。然而与梅花鹿产茸生产性能相关的ssr分子标记研究仅有以下几篇报道：有学者利用16个微卫星遗传标记对3个梅花鹿群体不同的基因型与产茸量之间进行了相关性分析，发现微卫星位点bm1225的bc、ce基因型和t172的aa基因型可作为兴凯湖梅花鹿种群的鲜茸重性状的分子遗传标记。同时，也有学者发现与马鹿产茸性状关联的微卫星位点不能用于标记东北梅花鹿，而nvhrt16微卫星位点标记可能用于梅花鹿的产茸量标记。在梅花鹿mhc-drb基因外显子2上发现drb3与产茸性能显著正相关，而drb8和drb11与二杠茸产量均呈显著负相关，对三叉茸重量则不明显。可见在茸用梅花鹿选育中可用的ssr分子标记仍十分有限。
综合以上关于茸用梅花鹿分子育种标记的研究仍存在一些问题，比如群体样本数量有限，另外生产性状记录不详，一般仅有鹿茸茸重数据，没有鹿茸其他参数信息，整体评价指标不全面等。以上原因导致至今国内外还没有筛选到与梅花鹿产茸生产性能相关的有效微卫星分子标记，极大地限制了梅花鹿物理图谱的构建以及茸用梅花鹿分子育种的进一步深入研究。因此，增加梅花鹿分子辅助育种的有效性，开发更多的新型ssr分子标记，成为当前茸用梅花鹿分子育种领域的重要课题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供一种梅花鹿微卫星位点m027的特异性扩增引物及其应用。
本发明一种梅花鹿微卫星位点m027的特异性扩增引物的核苷酸序列如seq.id.no：1和seq.id.no：2所示。
本发明梅花鹿微卫星位点m027在鹿茸生长性状分析中的应用。
梅花鹿微卫星位点m027的筛选方法，包括以下步骤：(1)转录组测序开发est-ssr：①提取梅花鹿样品的总rna，合成cdna，完成cdna第一链的合成，cdna第二链的合成，cdna双链末端修复，cdna3′末端腺苷酸化，测序接头拼接，琼脂糖电泳分离及片段回收，cdna片段扩增，测序文库质量检测，获得梅花鹿原始序列；②将步骤①中获得的原始序列按照以下步骤对测序结果进行初步处理：去除低质量片段(reads)：根据illumina自带软件将质量分数较低的片段去除，分析并去除接头：去除含有接头的序列，去除不能识别碱基含量大于5％的reads，得到去除低质量片段和接头的reads；③利用软件soap，将去除低质量片段和接头的经初步处理的reads定位到数据库参考基因上，最多允许产生2个碱基错配。评价mrna打断随机性：利用reads在基因上的分布来评价mrna打断随机性。由于不同参考基因有不同长度，所以将reads在基因上的位置标准化到相对位置，然后统计基因的不同位置比对上的reads数，得到unigenes。④通过picard-tools和samtools等专业软件的比对，去掉重复的reads，并对unigenes进行过滤。利用misa对unigenes进行est-ssr检测，搜索1～6碱基重复的est-ssr位点，参数设置为默认。使用软件misa对梅花鹿转录组中unigenes的cdna序列数据进行est-ssr位点分析，筛选的主要标准：重复单元长度2～6bp，二核苷酸重复次数≥10次；三、四核苷酸重复次数≥9次；五、六核苷酸重复次数≥8次。⑤使用软件primer3软件批量设计est-ssr引物，设定标准为：引物长度为18-23bp，gc含量为40％-60％，tm值55℃-65℃,并且上下游引物tm值相差不超过5℃，产物大小为150-400bp。(2)est-ssr引物对的有效性鉴定：①基因组dna的提取：梅花鹿基因组dna的提取方法参照全血基因组dna提取试剂盒说明书进行。将提取的dna溶液上样于1％琼脂糖凝胶，检测dna的位置、亮度和整齐度，以大体估计dna的质量。②荧光标记pcr扩增：pcr扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，挑选有目的条带产物在abi3730xl基因分析仪上检测。pcr扩增反应体系：8μl10×bufferi、0.4μltp-m13(5m)、2μl特异引物(5m)、0.2μltaq酶、2μldna、7.6μlddh2o。反应程序：95℃5min，94℃30s共30个循环，56℃45s、72℃45s、94℃30s、53℃45s、72℃45s、72℃12min、共10个循环。③利用全自动遗传分析仪abi3730xl进行毛细管电泳测序，电泳总体积为13μl：3μlpcr产物、10μl上样缓冲液hi-diformamide、0.5μlgs-500sizestandard(标准内参)。混匀后加样到96孔板中，然后高温变性并上机进行电泳检测。采用genotyperversion3.7软件分析确定微卫星片断长度和识别微卫星基因型。
本发明的有益效果：(1)本发明是根据基因型进行鹿茸生长性状选择，可筛选出鹿茸高产性状个体和鹿茸低产性状个体，精确度高，操作简单，费用低，在大规模选择条件下成本约为1元/头，并可以进行自动化规模检测；(2)利用本发明的微卫星分子标记方法可以在梅花鹿的生命早期(出生后l周内)即开始选择鹿茸生长性状，缩短世代间隔，提高选择强度，加速梅花鹿的育种进程。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种梅花鹿微卫星位点m027的特异性扩增引物的核苷酸序列如seq.id.no：1和seq.id.no：2所示。
本实施方式的有益效果：(1)本实施方式是根据基因型进行鹿茸生长性状选择，精确度高，操作简单，费用低，在大规模选择条件下成本约为1元/头，并可以进行自动化规模检测；(2)利用本实施方式的微卫星分子标记方法可以在梅花鹿的生命早期(出生后l周内)即开始选择鹿茸生长性状，缩短世代间隔，提高选择强度，加速梅花鹿的育种进程。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：梅花鹿微卫星位点m027所在的基因序列如seq.id.no：3所示。其他与具体实施方式一相同。
梅花鹿微卫星位点m027位于序列274-360bp处。
具体实施方式三：本实施方式梅花鹿微卫星位点m027在鹿茸生长性状分析中的应用。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：鹿茸生长性状为茸重。其他与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四不同的是：鹿茸生长性状为主干围度。其他与具体实施方式三或四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：采用梅花鹿微卫星位点m027分析鹿茸生长性状的方法：提取梅花鹿血液基因组dna，采用梅花鹿微卫星位点m027的引物进行荧光pcr扩增反应，取扩增产物在abi3730xl基因分析仪上进行毛细管电泳测序，筛选出263/295、289/321、289/293、289/291、251/291、317/317、289/317、289/289、287/289、263/289、277/291、287/287、291/317、289/311、321/321、291/291、279/289、279/317、263/263共19种基因型个体，其中289/321为鹿茸高产性状位点，263/263为低产性状位点。其他与具体实施方式一至五之一相同。
其中鹿茸高产性状是指茸重重量大和主干围度粗，低产性状是指茸重重量小和主干围度细。
具体实施方式七：本实施方式梅花鹿微卫星分子标记的筛选方法如下：
(1)构建转录组文库：测序平台为hiseqtm2500sequencingsystem，具体步骤如下：质量完好的梅花鹿样品mrna纯化富集，并片段化，完成cdna第一链的合成，cdna第二链的合成，cdna双链末端修复，cdna3′末端腺苷酸化，测序接头拼接，琼脂糖电泳分离及片段回收，cdna片段扩增，测序文库质量检测。测序完成后按照以下步骤对测序结果进行初步处理：去除低质量片段(reads)：根据illumina自带软件将质量分数较低的片段去除，分析并去除接头：去除含有接头的序列，去除不能识别碱基含量大于5％的reads。
(2)转录组数据的获得：利用软件soap，将去除低质量片段和接头的经初步处理的reads定位到数据库参考基因上，最多允许产生2个碱基错配。评价mrna打断随机性：利用reads在基因上的分布来评价mrna打断随机性。由于不同参考基因有不同长度，所以将reads在基因上的位置标准化到相对位置，然后统计基因的不同位置比对上的reads数，得到unigenes，其核苷酸序列如序列表seq.id.no：3所示。
(3)ssr位点查找：通过picard-tools和samtools等专业软件的比对，去掉重复的reads，并对unigenes进行过滤。利用misa对unigenes进行est-ssr检测，搜索1～6碱基重复的est-ssr位点，参数设置为默认。使用软件misa对梅花鹿转录组中unigenes的cdna序列数据进行est-ssr位点分析，筛选的主要标准：重复单元长度2～6bp，二核苷酸重复次数≥10次；三、四核苷酸重复次数≥9次；五、六核苷酸重复次数≥8次。
(3)设计est-ssr引物：使用软件primer3软件批量设计est-ssr引物，设定标准为：引物长度为18-23bp，gc含量为40％-60％，tm值55℃-65℃,并且上下游引物tm值相差不超过5℃，产物大小为150-400bp。
(4)est-ssr引物对的有效性鉴定：①基因组dna的提取：梅花鹿基因组dna的提取方法参照全血基因组dna提取试剂盒说明书进行。将提取的dna溶液上样于1％琼脂糖凝胶，检测dna的位置、亮度和整齐度，以大体估计dna的质量。②荧光标记pcr扩增：pcr扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，挑选有目的条带产物在abi3730xl基因分析仪上检测。pcr扩增反应体系：8μl10×bufferi、0.4μltp-m13(5m)、2μl特异引物(5m)、0.2μltaq酶、2μldna、7.6μlddh2o。反应程序：95℃5min，94℃30s共30个循环，56℃45s、72℃45s、94℃30s、53℃45s、72℃45s、72℃12min、共10个循环。③利用全自动遗传分析仪abi3730xl进行毛细管电泳测序，电泳总体积为13μl：3μlpcr产物、10μl上样缓冲液hi-diformamide、0.5μlgs-500sizestandard(标准内参)。混匀后加样到96孔板中，然后高温变性并上机进行电泳检测。genotyperversion3.7软件分析确定微卫星片断长度和识别微卫星基因型。
具体实施方式八：本实施方式鹿茸生产性状与微卫星标记的关联性分析方法如下：应用spss19.0软件对筛选的微卫星座位m027与鹿茸个体的性状(茸重、主干长度、主干围度、眉枝长度、眉枝围度、嘴头长度、嘴头围度)进行单标记回归分析，用以检验标记与性状的关联程度。其中以微卫星位点的某一基因型的生长相关性状均值显著高于其他基因型的均值，且高于群体生长性状的均值作为群体优势基因型的评定标准。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1：本实施例应用微卫星m027位点选择双阳梅花鹿鹿茸生长性状的方法如下：
(1)设计微卫星m027位点的特异性荧光引物：正向引物：m13-ttcctcactttcctcatacatctg，反向引物：atcttccagtcaggtgttcagc。
(2)鹿茸生长性状测量：随机选取140只健康的2岁雄性双阳梅花鹿，通过注射鹿眠宝3号(0.02mg/kg)对梅花鹿进行全身麻醉。10min左右，梅花鹿进入麻醉状态，颈静脉下采血。取血完毕后，用麻绳在鹿茸的根部扎紧，用消毒后的锯从鹿茸根部将其锯下来，通过注射鹿醒宝3号(0.02mg/kg)对梅花鹿进行复苏。最后测量鹿茸的相关参数，包括茸重、主干长度、主干围度、眉枝长度、眉枝围度、嘴头长度和嘴头围度。
(3)荧光标记pcr扩增：基因组dna的提取：梅花鹿基因组dna的提取方法参照全血基因组dna提取试剂盒说明书进行。将提取的dna溶液上样于1％琼脂糖凝胶，检测dna的位置、亮度和整齐度，以大体估计dna的质量。进一步pcr扩增。pcr扩增反应体系：8μl10×bufferi、0.4μltp-m13(5m)、2μl特异引物(5m)、0.2μltaq酶、2μldna、7.6μlddh2o。反应程序：95℃5min，94℃30s共30个循环，56℃45s、72℃45s、94℃30s、53℃45s、72℃45s、72℃12min、共10个循环。
(4)pcr扩增产物的多态性分析：利用全自动遗传分析仪abi3730xl进行毛细管电泳测序，电泳总体积为13μl：3μlpcr产物、10μl上样缓冲液hi-diformamide、0.5μlgs-500sizestandard(标准内参)。混匀后加样到96孔板中，然后高温变性并上机进行电泳检测。然后以等位基因分型标准物(rox)分子量为标准，根据dna片段长度变异范围和峰形特征确认等位基因型，m027位点筛选出263/295、289/321、289/293、289/291、251/291、317/317、289/317、289/289、287/289、263/289、277/291、287/287、291/317、289/311、321/321、291/291、279/289、279/317、263/263共19种基因型个体。由表1梅花鹿微卫星m027与鹿茸生长性状的相关性分析可知，其中基因型289/321与茸重和主干围度的均值较高，普遍高于其他基因型个体，且与基因型263/263间差异显著。结合含有251、263、277、279、287、289、291、293、295、311、317和321等位基因的个体均值可以推测，等位基因289和321对梅花鹿二杠茸重和主干围度起正面影响。基因型263/263与茸重和主干围度的均值最低，因此等位基因263可能对梅花鹿二杠茸重和主干围度起负面影响。
表1梅花鹿微卫星m027与鹿茸生长性状的相关性分析
(5)高产鹿茸个体的选择：m027位点289/321作为高产二杠鹿茸个体优势基因型，优先选留，263/263作为低产二杠鹿茸个体基因型，建议淘汰。
综上所述，本实施例是根据基因型进行鹿茸生长性状选择，可筛选出鹿茸高产性状个体和鹿茸低产性状个体，精确度高，操作简单；利用本实施例的微卫星分子标记方法可以在梅花鹿的生命早期(出生后l周内)即开始选择鹿茸生长性状，缩短世代间隔，提高选择强度，加速梅花鹿的育种进程。
序列表
<110>吉林农业大学
<120>一种梅花鹿微卫星位点m027的特异性扩增引物及其应用
<160>3
<210>1
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星m027位点的正向引物。
<400>1
m13-ttcctcactttcctcatacatctg28
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>微卫星m027位点的反向引物。
<400>2
atcttccagtcaggtgttcagc22
<210>3
<211>445
<212>dna
<213>梅花鹿
<400>3
acaactgaagcatcttagcatgcacgcatagtaagattttctatatctaggataacatcc60
ttaagagagacctgaaaaaagcattctgatgatccctgaatctagagtcaggcccacaca120
gtccaggtgaagtctttgccttagtttaagagcatatcttccagtcaggtgttcagcctt180
gaattgagtcagggccagcttcttcatttgtgtggttctctggaacacatacactcgcca240
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