一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，是呼吸道感染的常见细菌，其分布十分广泛，在免疫功能受损的病人中能够引起严重感染。

环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种新的核酸扩增技术，其具有检测周期短、灵敏度高、设备简单以及产物检测便捷等优点。然而，由于现有lamp引物组的特异性较差，目前主要是通过lamp技术来检测食品中的铜绿假单胞菌，其不易对痰液等其他样品中的铜绿假单胞菌进行检测，因此存在着一定的局限性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组，包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；

所述上游外部引物的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示：cggsgcwgtcsagaac；

所述下游外部引物的核苷酸序列如序列表seqidno:2所示：tgscggaaawgccgwaag；

所述上游内部引物的核苷酸序列如序列表seqidno:3所示：accstcgatacgstttcccgtwgtgaggwgtscgwgtggtt；

所述下游内部引物的核苷酸序列如序列表seqidno:4所示：tcsaatccctcsctcaccgsggtgcsgaaatgwaaawggc；

所述上游环状引物的核苷酸序列如序列表seqidno:5所示：tcsagscgtgcwccttc；

所述下游环状引物的核苷酸序列如序列表seqidno:6所示：awggccsggctwatcwagtt；

其中，上述核苷酸序列中的w代表a或t，s代表g或c。

本发明实施例还提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，其包括核酸提取试剂、复溶液、甜菜碱以及引物组混合物，所述的引物组混合物包括上述引物组中的各个引物。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组混合物包括以下按照体积份计的组分：上游外部引物4-6份、下游外部引物4-6份、上游内部引物3-5份、下游内部引物3-5份、上游环状引物18-22份、下游环状引物18-22份。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组中，上游外部引物和下游外部引物的摩尔浓度均为4-6pmol/μl。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组中，上游内部引物和下游内部引物的摩尔浓度均为30-50pmol/μl。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的引物组中，上游环状引物和下游环状引物的摩尔浓度均为10-30pmol/μl。

本发明实施例提供的一种优选方案，所述甜菜碱的摩尔浓度为4-6mol/l。

本发明实施例还提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的方法，该方法是采用上述试剂盒进行检测，其包括以下步骤：

(1)利用核酸提取试剂提取待测样品的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)，得到dna提取液；

(2)将dna提取液、复溶液、甜菜碱和引物组混合物进行混合，得到反应液；

(3)将反应液进行聚合酶链式(polymerasechainreaction，pcr)扩增反应，根据pcr扩增反应结果判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(3)中，pcr扩增反应的温度为60-65℃。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(3)中，根据pcr扩增反应结果的ct值判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌；若ct值不大于55，则待测样品中含有铜绿假单胞菌；若ct值大于55，则待测样品中不含有铜绿假单胞菌。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例提供的lamp引物组具有良好的特异性，使用该引物组可以快速有效地检测出痰液中的铜绿假单胞菌，而且操作简单、方便。

附图说明

图1为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(a/b)。

图2为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(a/c)。

图3为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(a/d)。

图4为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(a/e)。

图5为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(a/f)。

图6为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(a/g)。

图7为实施例5得到的实时荧光扩增曲线(a/h)。

图8为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(a/b)。

图9为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(a/c)。

图10为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(a/d)。

图11为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(a/e)。

图12为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(a/f)。

图13为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(a/g)。

图14为实施例5得到的实时荧光溶解曲线(a/h)。

图15为实施例6得到的实时荧光扩增曲线。

图16为实施例7得到的实时荧光扩增曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。

实施例1

该实施例提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组以及含有该引物组的试剂盒，具体的，该引物组是采用primerexplorerv5设计的lamp引物组，其包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；其中，所述上游外部引物的核苷酸序列为：cggcgctgtccagaac；所述下游外部引物的核苷酸序列为：tgccggaaatgccgtaag；所述上游内部引物的核苷酸序列为：accctcgatacgctttcccgttgtgaggtgtccgtgtggtt；所述下游内部引物的核苷酸序列为：tccaatccctccctcaccgcggtgccgaaatgtaaatggc；所述上游环状引物的核苷酸序列为：tccagccgtgctccttc；所述下游环状引物的核苷酸序列为：atggcccggcttatctagtt。

另外，该试剂盒包括核酸提取试剂、复溶液、4mol/l的甜菜碱以及引物组混合物，其中，引物组混合物包括以下组分：上游外部引物4μl、下游外部引物4μl、上游内部引物3μl、下游内部引物3μl、上游环状引物18μl、下游环状引物18μl。另外，上游外部引物和下游外部引物的摩尔浓度均为4pmol/μl；上游内部引物和下游内部引物的摩尔浓度均为30pmol/μl；上游环状引物和下游环状引物的摩尔浓度均为10pmol/μl；核酸提取试剂可以根据不同待测样品进行选择，譬如可以选用广州华峰生物科技有限公司的“铜绿假单孢菌核酸检测试剂盒”中的核酸提取试剂，复溶液可选用广州华峰生物科技有限公司市售的产品。

实施例2

该实施例提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组以及含有该引物组的试剂盒，具体的，该引物组是采用primerexplorerv5设计的lamp引物组，其包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；其中，所述上游外部引物的核苷酸序列为：cggggcagtcgagaac；所述下游外部引物的核苷酸序列为：tgccggaaaagccgaaag；所述上游内部引物的核苷酸序列为：accctcgatacgctttcccgttgtgaggtgtccgtgtggtt；所述下游内部引物的核苷酸序列为：tcgaatccctcgctcaccggggtgcggaaatgtaaatggc；所述上游环状引物的核苷酸序列为：tcgaggcgtgcaccttc；所述下游环状引物的核苷酸序列为：aaggcccggctaatcaagtt。

另外，该试剂盒包括核酸提取试剂、复溶液、6mol/l的甜菜碱以及引物组混合物，其中，引物组混合物包括以下组分：上游外部引物6μl、下游外部引物6μl、上游内部引物5μl、下游内部引物5μl、上游环状引物22μl、下游环状引物22μl。另外，上游外部引物和下游外部引物的摩尔浓度均为6pmol/μl；上游内部引物和下游内部引物的摩尔浓度均为50pmol/μl；上游环状引物和下游环状引物的摩尔浓度均为30pmol/μl；核酸提取试剂可以根据不同待测样品进行选择，譬如可以选用广州华峰生物科技有限公司的“铜绿假单孢菌核酸检测试剂盒”中的核酸提取试剂，复溶液可选用广州华峰生物科技有限公司市售“通用核酸检测试剂盒”的产品。

实施例3

该实施例提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组以及含有该引物组的试剂盒，具体的，该引物组是采用primerexplorerv5设计的lamp引物组，其包括上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环状引物和下游环状引物；其中，所述上游外部引物的核苷酸序列为：cggcgctgtcgagaac；所述下游外部引物的核苷酸序列为：tgccggaaatgccgtaag；所述上游内部引物的核苷酸序列为：accctcgatacggtttcccgtagtgaggtgtccgagtggtt；所述下游内部引物的核苷酸序列为：tcgaatccctccctcaccgcggtgcggaaatgaaaaaggc；所述上游环状引物的核苷酸序列为：tccaggcgtgctccttc；所述下游环状引物的核苷酸序列为：aaggcccggctaatcaagtt。

另外，该试剂盒包括核酸提取试剂、复溶液、5mol/l的甜菜碱以及引物组混合物，其中，引物组混合物包括以下组分：上游外部引物5μl、下游外部引物5μl、上游内部引物4μl、下游内部引物4μl、上游环状引物20μl、下游环状引物20μl。另外，上游外部引物和下游外部引物的摩尔浓度均为5pmol/μl；上游内部引物和下游内部引物的摩尔浓度均为40pmol/μl；上游环状引物和下游环状引物的摩尔浓度均为20pmol/μl；核酸提取试剂可以选用常州百代生物科技有限公司的市售产品，其包括裂解液、消化液、析出液、洗涤液和洗脱液等，复溶液可选用广州华峰生物科技有限公司市售“通用核酸检测试剂盒”的产品。

实施例4

该实施例提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的方法，该方法是采用上述实施例3的试剂盒进行检测的，具体包括以下步骤：

(1)向收集的痰液中加入4倍体积1mol/l的naoh，在室温条件下放置20-30min，每10min振荡混匀一次，然后在12000rpm的转速下离心5min后，弃上清，再加入0.5ml的生理盐水混匀，然后继续在12000rpm的转速下离心5min，弃400μl上清，剩余100μl上清，并充分振荡混匀15秒，得到粗提液。

(2)往上述粗提液中加入200μl裂解液和20μl消化液，振荡混匀，并进行56℃水浴10min后，再加入500μl析出液，并轻轻颠倒混匀，得到混合液。

(3)先将吸附柱放入收集管内，并将上述溶液转入吸附柱内，静置3min后，再置于12000rpm、4℃的条件下离心1min，弃收集管内的废液；接着，将吸附柱放回收集管内，加500μl洗涤液至吸附柱内，同样置于12000rpm、4℃的条件下离心1min，弃收集管内的废液；然后，将吸附柱放回收集管内，同样置于12000rpm、4℃的条件下离心1min，离去残留的洗涤液。

(4)取出吸附柱，放入新的1.5ml离心管内，并加入40μl的洗脱液，静置3min后，再置于12000rpm、4℃的条件下离心2min，收集dna溶液，即可得到dna提取液。

(5)取2μl的dna提取液、10μl的复溶液、3μl的甜菜碱、5.8μl引物组混合物，并补充超纯水至25μl，进行混合，得到反应液。

(6)将反应液置于苏州雅睿生物技术有限公司1620q系列便携式实时荧光定量pcr仪中进行pcr扩增反应；其中，pcr仪顶盖的温度为104℃，通道为fam，循环数为60，反应温度65℃。

(7)根据pcr扩增反应结果的ct值判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌；具体的，若ct值不大于55，则待测样品痰液中含有铜绿假单胞菌；若ct值大于55，则待测样品痰液中不含有铜绿假单胞菌。

实施例5

该实施例是对上述实施例3的引物组的特异性进行测试，该测试方法具体包括以下步骤：

(1)在25℃的条件下，使用增菌培养基对铜绿假单胞菌进行培养14h后，再进行dna提取，得到dna提取液。

(2)取2μl的dna提取液、10μl的复溶液、3μl的甜菜碱、5.8μl引物组混合物，并补充超纯水至25μl，进行混合，得到反应液。

(3)将反应液置于苏州雅睿生物技术有限公司1620q系列便携式实时荧光定量pcr仪中进行pcr扩增反应，记为a；其中，pcr仪顶盖的温度为104℃，通道为fam，循环数为60，反应温度60℃。

(4)用与步骤(1)-(3)相同的方法分别对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、生孢梭菌、黑曲霉以及去离子水(阴性对照组)进行pcr扩增反应，并分别记为b、c、d、e、f、g、h，其对应的实时荧光扩增曲线与a的对比图如附图1-7所示，其对应的实时荧光溶解曲线与a的对比图分别如附图8-14所示。

从图1-14中可以看出，只有铜绿假单孢菌的dna提取液出现了扩增信号，且其溶解曲线为单一峰，说明本发明实施例提供的引物组的特异性良好，其只能检测出铜绿假单孢菌。

实施例6

该实施例提供了不同体积的反应液对铜绿假单孢菌进行pcr扩增反应实验，具体包括以下步骤：

(1)在25℃的条件下，使用增菌培养基对铜绿假单胞菌进行培养14h后，再进行dna提取，得到dna提取液。

(2)取3μl的dna提取液、10μl的复溶液、2μl的甜菜碱、0.5μl的上游外部引物、0.5μl的下游外部引物、0.4μl的上游内部引物、0.4μl的下游内部引物、2μl的上游环状引物和2μl的下游环状引物，并补充超纯水至25μl，进行混合，得到反应液。

(3)将反应液置于苏州雅睿生物技术有限公司1620q系列便携式实时荧光定量pcr仪中进行pcr扩增反应，记为i，其得到的铜绿假单胞菌的实时荧光扩增曲线如附图15所示；其中，pcr仪顶盖的温度为103℃，通道为fam，循环数为60，反应温度65℃。

(4)取1μl的dna提取液、5μl的复溶液、1μl的甜菜碱、0.3μl的上游外部引物、0.3μl的下游外部引物、0.24μl的上游内部引物、0.24μl的下游内部引物、1.2μl的上游环状引物和1.2μl的下游环状引物，并补充超纯水至15μl，进行混合，得到反应液。

(5)将反应液置于苏州雅睿生物技术有限公司1620q系列便携式实时荧光定量pcr仪中进行pcr扩增反应，记为j，其得到的铜绿假单胞菌的实时荧光扩增曲线如附图15所示；其中，pcr仪顶盖的温度为104℃，通道为fam，循环数为60，反应温度65℃。

(6)取0.5μl的dna提取液、1μl的复溶液、0.5μl的甜菜碱、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，并补充超纯水至5μl，进行混合，得到反应液。

(7)将反应液置于苏州雅睿生物技术有限公司1620q系列便携式实时荧光定量pcr仪中进行pcr扩增反应，记为k，其得到的铜绿假单胞菌的实时荧光扩增曲线如附图15所示；其中，pcr仪顶盖的温度为104℃，通道为fam，循环数为60，反应温度65℃。

(8)取0.2μl的dna提取液、0.5μl的复溶液、0.2μl的甜菜碱、0.05μl的上游外部引物、0.05μl的下游外部引物、0.03μl的上游内部引物、0.03μl的下游内部引物、0.15μl的上游环状引物和0.15μl的下游环状引物，并补充超纯水至2μl，进行混合，得到反应液。

(9)将反应液置于苏州雅睿生物技术有限公司1620q系列便携式实时荧光定量pcr仪中进行pcr扩增反应，记为l，其得到的铜绿假单胞菌的实时荧光扩增曲线如附图15所示；其中，pcr仪顶盖的温度为104℃，通道为fam，循环数为60，反应温度65℃。

从图15中可以看出，使用本发明实施例提供的引物组对铜绿假单孢菌进行检测所需的反应液最小体积为5μl。

实施例7

该实施例提供了不同体积的复溶液和甜菜碱对铜绿假单孢菌进行pcr扩增反应实验，具体包括以下步骤：

(1)在25℃的条件下，使用增菌培养基对铜绿假单胞菌进行培养14h后，再进行dna提取，得到dna提取液。

(2)取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、0.2μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到m反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、0.4μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到n反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、0.6μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到o反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、0.8μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到p反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、1μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到q反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、1.2μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到r反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、1.4μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到s反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、1.6μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到t反应液；

取0.44μl的dna提取液、1.8μl的复溶液、0.4μl的甜菜碱、2μl超纯水、0.1μl的上游外部引物、0.1μl的下游外部引物、0.08μl的上游内部引物、0.08μl的下游内部引物、0.4μl的上游环状引物和0.4μl的下游环状引物，进行混合，得到u反应液。

(3)将上述m-u反应液分别置于苏州雅睿生物技术有限公司1620q系列便携式实时荧光定量pcr仪中进行pcr扩增反应，其对应得到的铜绿假单胞菌的实时荧光扩增曲线如附图16所示；其中，pcr仪顶盖的温度为103℃，通道为fam，循环数为50，反应温度63℃。

从图16中可以看出，当复溶液、甜菜碱和超纯水等公用试剂的总用量为2.4μl时，实时荧光无信号，当公用试剂的总用量为4.2和4.4时，实时荧光信号不稳定，其中最佳容忍误差范围的公用试剂的总用量为3.4±0.8。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

序列表

<110>贵州金玖生物技术有限公司

<120>一种用于检测铜绿假单胞菌的引物组、试剂盒及方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cggsgcwgtcsagaac16

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

awggccsggctwatcwagtt20