一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和PSR方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和psr方法。

背景技术：

肺炎克雷伯杆菌(klebsiellapneumoniae)是一种主要的导致体内感染的革兰氏阴性菌，它会引起肺炎、泌尿道和伤口感染等疾病，在婴儿、糖尿病患者、肿瘤患者、长期使用抗生素的病人和老年人中发病率高。此外，近些年来越来越普遍的耐药肺炎克雷伯杆菌已成为临床上一个重要难题，因此需要建立一种快速和敏感的检测方法。

肺炎克雷伯杆菌的传统检测方法包括基于表型和生理生化指标的微生物镜检法、生化鉴定法和最新的全自动细菌鉴定仪，但这些方法耗时长、灵敏度低，经常需要数天的细菌培养时间。近些年来，一系列新发明的分子生物学技术被用来检测肺炎克雷伯杆菌，如用基于16s-23s内部转录间隔区的pcr在婴儿奶粉中检测肺炎克雷伯杆菌，也有三重pcr和实时荧光定量pcr的肺炎克雷伯杆菌检测技术，然而这些技术都相对比较复杂，需要专业的、昂贵的仪器，此外pcr中使用的taq酶容易被原始样本中的抑制物抑制而失活。

因此，提供一种利用聚合酶螺旋反应(psr)检测肺炎克雷伯杆菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和psr方法，操作简单，灵敏度高，特异性强。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

荚膜多糖(cps)是肺炎克雷伯杆菌的重要致病因子，而rcsa基因调控荚膜多糖的合成，并且是肺炎克雷伯杆菌的特有基因，因此本发明选它作为肺炎克雷伯杆菌检测的靶基因，根据rcsa基因序列设计一套psr引物，并评价其最佳温度、特异性和敏感性，最终用完善后的方法来应用于样本检测。

一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合，具体引物序列如下：

rcsa-ft1：5’-cgacgtacagtgtttctgcagtaaaaaacaggaaatcgttgagg-3’；seqidno.1；

rcsa-bt1：5’-cgacgtacagtgtttctgcaggcgaataatgccattactttc-3’；seqidno.2；

rcsa-if：5’-atccgcagcactgttga-3’；seqidno.9；

rcsa-ib：5’-gaagactgtttcgtgcatgatga-3’；seqidno.10。

进一步，含有上述引物组合的试剂盒。

一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的psr方法，包括如下步骤：用上述的引物组合对待测样本进行psr反应，检测psr反应产物，确定待测样本是否为肺炎克雷伯杆菌。

进一步，所述psr反应体系如下：12.5μl的2×rm，2.0μldna模板和1.0μlbstdna聚合酶，引物的rcsa-ft1、rcsa-bt1各1.6μm，rcsa-if、rcsa-ib各0.8μm，并用水补齐25μl。

进一步，所述psr反应条件为65℃，60min。

进一步，所述确定待测样本是否为肺炎克雷伯杆菌的方法为a、b、c或d：

a、钙黄绿素显色法

在psr反应体系中加入1.0μl钙黄绿素指示剂；恒温扩增反应结束后，若待检样品反应管液体呈黄绿色，表示检出肺炎克雷伯杆菌，该样品检测结果为阳性；若待检样品反应管液体呈橙红色，表示未检出肺炎克雷伯杆菌，检测结果为阴性；

b、ph指示剂显色法

在psr反应体系中加入1.0μlph指示剂(0.08mm甲酚红和0.02mm苯酚红)；恒温扩增反应结束后，若待检样品反应管液体呈黄色，表示待测样本中存在肺炎克雷伯杆菌；若待检样品反应管液体呈红色，表示待测样本中不存在肺炎克雷伯杆菌；如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色无变化，则本次检测结果无效，应重新检测；

c、浊度法

浊度仪检测所述待测样本psr反应产物浊度变化曲线，若所述待测样本psr反应产物浊度变化曲线呈s型反应曲线，则待测样本中存在肺炎克雷伯杆菌，若所述待测样本psr反应产物浊度变化曲线未形成明显s型反应曲线，则所述待测样本中不存在肺炎克雷伯杆菌；

d、荧光法

阳性反应的表现为：在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；阴性反应的表现为：在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现；结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，待检样本在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近(tm变化范围在1-3℃之内)，此时待检样本判断为阳性，否则为阴性；如果阳性待检样本发生了阴性反应，或者阴性待检样本发生了阳性反应，应重新检测。

钙黄绿素显色法：钙黄绿素是一种金属螯合剂；在反应前，钙黄绿素与mn²⁺络合，mn²⁺猝灭了钙黄绿素的荧光，反应液呈橙红色，此时溶液中的镁呈二价离子状态，不会置换mn²⁺；而当发生psr反应后，会生成大量的焦磷酸酶沉淀，此时mn²⁺就会与mg2p2o7发生置换反应生成mn2p2o7和mg²⁺，而mg²⁺不具有猝灭钙黄绿素荧光的作用，荧光得以释放使溶液由橙色变成绿色。当反应为阴性时，溶液保持橙红色不变；反应后呈黄绿色判为阳性，橙红色则为阴性。

ph指示剂显色法检测：恒温扩增反应结束后，冷却至室温后观察结果，检测管变黄表示待测样本中存在肺炎克雷伯杆菌基因(阳性)，检测管颜色无变化(红色)表示待测样本中不存在肺炎克雷伯杆菌基因(阴性)。如果阴性对照管变为黄色，或者阳性对照管50分钟内颜色无变化(红色)，则本次检测结果无效，应重新检测。

ph指示剂显色法检测原理为：当dna聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的dna双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着psr反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的ph值降低。将ph指示剂溶液加于25μl上述psr反应体系中，阳性反应变为黄色，阴性对照溶液维持红色不变。

浊度法检测原理为：在psr反应过程中形成mg2p2o7即焦磷酸镁，为白色沉淀，发生反应式如下:

(dna)n-1+dntp→(dna)n+p2o7^4-

p2o7^4-+2mg²⁺-→mg2p2o7↓。

据此反应原理，实时浊度仪la-320c每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性；形成反应曲线-s型折线，则为阳性；未形成明显反应曲线-无s型折线，则为阴性。

荧光实时检测方法为：设定吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm，此波长和sybrgreeni相同，为绿色荧光；将反应体系置于荧光定量仪中，开始反应。

阳性反应的表现为：在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；阴性反应的表现为：在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，样本在反应阶段出现s型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近(tm变化范围在1-3℃之内)，此时样本可以判断为阳性，否则为阴性。如果阳性样本发生了阴性反应，或者阴性样本发生了阳性反应，应重新实验。

荧光实时检测方法的原理为：核酸荧光染料可以镶嵌到dna双链里，在特定激发波长荧光激发下，可以发出荧光，进而被仪器检测到。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和psr方法，操作简便，反应时间短，灵敏度高，是普通pcr反应的10倍，特异性强，仅能检测出肺炎克雷伯杆菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明筛选肺炎克雷伯杆菌的psr最佳引物；

图2附图为本发明肺炎克雷伯杆菌psr检测特异性-实时浊度法；

图3附图为本发明肺炎克雷伯杆菌psr检测特异性-钙黄绿素显色法；

图4附图为本发明肺炎克雷伯杆菌psr检测特异性-ph指示剂显色法；

其中，图2-图4中，1，阳性对照(k.pneumoniaeatccbaa-2146)；2，阴性对照(纯水)；3，klebsiellaoxytocaatcc700324；4，klebsiellarhinoscleromatiscmcc46111；5，citrobacterfreundiicmcc48001；6，proteusmirabiliscmcc49005；7，proteusvulgariscmcc49027；8，serratiamarcescensatcc14756；9，morganellamorganiiatcc25830；10，enterobacteraerogenesatcc13048；11，enterobactercloacaeatcc13047；12，streptococcuspneumoniae112-07；13，mycobacteriumtuberculosis005；14，pseudomonasaeruginosad104；15，haemophilusinfluenzaatcc49247；16，yersiniaenterocolitica027；17，yersiniapestis2638；18，bacillustularense3450；19，vibriocholera3802；20，salmonellaaberdeen9264；21，neisseriameningitidescmcc29022；22，staphylococcusaureus2740；23，pseudomonaspseudomallei029；24，salmonellatyphimurium4030；25，corynebacteriumdiphtheriaecmcc38001；26，bacillusmegatherium4623；27，stenotrophomonasmaltophiliak279a；28，legionellapneumophila9135；29，acinetobacterbaumannii12101；30，enteroinvasivee.coli44825；31，enterotoxigenice.coli44824；32，enteropathogenice.coli2348；

图5附图为本发明肺炎克雷伯杆菌psr方法敏感性检测-浊度法；

图6附图为本发明肺炎克雷伯杆菌psr方法敏感性检测-钙黄绿素显色法；

图7附图为本发明肺炎克雷伯杆菌psr方法敏感性检测-ph指示剂显色法；

图8附图为本发明肺炎克雷伯杆菌普通pcr法敏感性检测；

其中，图5-图8中，1，阴性对照(纯水)；2，115.0ng/l；3，11.5ng/l；4，1.15ng/l；5，115.0pg/l；6，11.5pg/l；7，1.15pg/l；8，0.115pg/l；pcr目的片段大小为176bp；

图9附图为本发明临床样本中肺炎克雷伯杆菌荧光法敏感性检测；

其中，1，115.0ng/l；2，11.5ng/l；3，1.15ng/l；4，115.0pg/l；7，11.5pg/l；5，1.15pg/l；6，0.115pg/l；8，阴性对照(纯水)；

图10附图为本发明临床样本中肺炎克雷伯杆菌钙黄绿素显色法检测；

其中，1，阴性对照(纯水)；2，阳性对照(k.pneumoniaeatccbaa-2146)；3-34为分离自疑似感染病人的不同编号的32株肺炎克雷伯杆菌：3，k.pneumoniaewj-48；4，k.pneumoniaewj-50；5，k.pneumoniaewj-51；6，k.pneumoniaewj-52；7，k.pneumoniaewj-53；8，k.pneumoniaewj-57；9，k.pneumoniaewj-58；10，k.pneumoniaewj-60；11，k.pneumoniaewj-61；12，k.pneumoniaewj-64；13，k.pneumoniaewj-65；14，k.pneumoniaewj-66；15，k.pneumoniaewj-68；16，k.pneumoniae301-052；17，k.pneumoniae301-207；18，k.pneumoniae301-263；19，k.pneumoniae301-432；20，k.pneumoniae301-416；21，k.pneumoniae301-323；22，k.pneumoniae301-365；23，k.pneumoniae301-282；24，k.pneumoniae301-406；25，k.pneumoniae301-158；26，k.pneumoniae307-206；27，k.pneumoniae307-082；28，k.pneumoniae307-429；29，k.pneumoniae307-095；30，k.pneumoniae307-003；31，k.pneumoniae307-030；32，k.pneumoniae307-194；33，k.pneumoniae307-356；34，k.pneumoniae307-235。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

反应混合液(reactionmixture，2×rm)的配制

(1)20×rmpre的配制：取2.64g硫酸铵，1.49g氯化钾，3.95g七水硫酸镁，2.0ml吐温20于100ml容量瓶中，充分溶解，用1％koh溶液调节ph至8.0，最后定容到100ml，4℃保存。

(2)甜菜碱溶液(0.375g/ml)配制：取7.5g甜菜碱于20ml容量瓶中，充分溶解并定容到20ml，4℃保存。

(3)2×rm的配制：psr的反应缓冲液应避免反复冻融，故一般配成2ml的小体系；吸取200μl的20×rmpre于2ml离心管中，加入53.33μl的tris-hcl溶液(1.5m，ph8.8)，1.0ml甜菜碱溶液(0.375g/ml)，加入746.67μl去离子水补齐2ml，于-20℃保存。

bstdna大片段聚合酶(neb公司)；2×taqpcrmastermix(北京天根)。

实施例1psr反应

psr反应体系采用25μl体系：包括12.5μl的2×rm，2.0μldna模板和1.0μlbstdna聚合酶，每套引物的ft、bt各1.6μm，if、ib各0.8μm，并用水补齐25μl。

当采用钙黄绿素做显色判读时，在psr反应体系中加入1.0μl钙黄绿素指示剂，总体积为26μl。

当采用ph指示剂做显色判读时，加入1.0μlph指示剂(0.08mm甲酚红和0.02mm苯酚红)，总体积为26μl。

psr反应程序为65℃，60min。

用psr反应分析检测肺炎克雷伯杆菌时的最佳引物、特异性及敏感性。

实施例2肺炎克雷伯杆菌psr引物设计

肺炎克雷伯杆菌rcsa基因序列来自genebank网站(accessionnumber：7946097)，并上传至blast网站进行序列对比，对比结果显示都是肺炎克雷伯杆菌，表明rcsa基因对于肺炎克雷伯杆菌有良好的特异性，可用于设计肺炎克雷伯杆菌检测的特异psr引物。

针对肺炎克雷伯杆菌rcsa基因设计4套psr引物(kp-1、kp-2、kp-3、kp-4)，共用一对加速引物(if、ib)，引物名称及序列如表1所示。

表1针对rcsa基因设计的4套psr引物

在65℃条件下反应60min，比较表1的4套引物，结果如图1所示，显示kp-1引物ct值最小，因此将其作为肺炎克雷伯菌检测的最佳psr引物。

实施例3肺炎克雷伯杆菌psr检测特异性

为评价psr反应检测肺炎克雷伯杆菌时的特异性，从肺炎克雷伯杆菌atccbaa-2146和产酸克雷伯菌klebsiellaoxytocaatcc700324、鼻硬结克雷伯氏菌klebsiellarhinoscleromatiscmcc46111、弗劳地枸橼酸杆菌citrobacterfreundiicmcc48001、奇异变形杆菌proteusmirabiliscmcc49005、普通变形杆菌proteusvulgariscmcc49027、粘质沙雷氏菌serratiamarcescensatcc14756、摩氏摩根菌morganellamorganiiatcc25830、产气肠杆菌enterobacteraerogenesatcc13048、阴沟肠杆菌enterobactercloacaeatcc13047、肺炎链球菌streptococcuspneumoniae112-07、结核杆菌mycobacteriumtuberculosis005、铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosad104、嗜血流杆菌haemophilusinfluenzaatcc49247、小肠结肠炎耶尔森菌yersiniaenterocolitica027、鼠疫耶尔森菌yersiniapestis2638、土拉杆菌bacillustularense3450、霍乱弧菌vibriocholera3802、阿伯丁沙门菌salmonellaaberdeen9264、脑膜炎双球菌neisseriameningitidescmcc29022、金黄色葡萄球菌staphylococcusaureus2740、类鼻疽假单胞菌pseudomonaspseudomallei029、鼠伤寒沙门氏菌salmonellatyphimurium4030、白喉杆菌corynebacteriumdiphtheriaecmcc38001、巨大芽胞杆菌bacillusmegatherium4623、嗜麦芽寡养单胞菌stenotrophomonasmaltophiliak279a、嗜肺军团菌legionellapneumophila9135、鲍曼不动杆菌acinetobacterbaumannii12101、肠侵袭性大肠杆菌enteroinvasivee.coli44825、肠产毒性大肠杆菌enterotoxigenice.coli44824、肠致病性大肠杆菌enteropathogenice.coli2348等非肺炎克雷伯杆菌的细菌中提取基因组dna，并用psr方法进行检测。结果显示，实时浊度法(图2)与钙黄绿素显色法(图3)和ph指示剂显色法(图4)都准确地鉴定出肺炎克雷伯杆菌，其它同为克雷伯杆菌属或其它菌属的细菌连同纯水都是阴性结果，表明psr法在检测肺炎克雷伯杆菌时具有良好的特异性。

实施例4psr与pcr敏感性的对比

为比较psr(包括实时浊度法与显色法)同常规pcr法在检测肺炎克雷伯杆菌时的敏感性，将k.pneumoniaeatccbaa-2146基因组核酸用纯水做10倍梯度稀释，从115.0ng/μl稀释到0.115pg/μl，并取2.0μl模板上样。

pcr反应采用25μl体系，包括12.5μl的pcrmastermix，上游引物kp-f和下游引物kp-b各0.5m，所用dna模板与psr反应相同，用纯水补齐25μl。pcr退火温度设为55℃，产物用1％琼脂糖凝胶(amresco)做水平电泳，并用紫外成像仪(bio-rad)照胶。

其中，上下游引物的序列如下：

kp-f：5’-ggatatctgaccagtcgg-3’；seqidno.11；

kp-b：5’-gggttttgcgtaatgatctg-3’；seqidno.12。

浊度法用实时浊度仪在波长650nm处每6s进行一次监测，显色法在恒温金属浴中反应，反应开始前在25μlpsr反应体系中加入1μl钙黄绿素指示剂。结果显示，psr的浊度法(图5)、显色法(图6-7)和荧光法(图9)均能检测到第五个梯度，即11.5pg/μl，而普通pcr法(图8)的第五个梯度(泳道6)虽然有条带，但不是很明显，表明psr法在检测肺炎克雷伯菌时敏感性是普通pcr的10倍。

实施例5psr方法在临床检测肺炎克雷伯菌时的应用

用110份疑似多重感染的icu病人与10位健康人志愿者的痰液样本评估psr在临床检测肺炎克雷伯菌的效用，同时用psr法(钙黄绿素显色法)与普通pcr法分析所有的样本，结果见图10，在110份临床样本中，32份样本psr阳性，25份样本pcr阳性，所有的pcr阳性样本均被psr检测出来，而所有的健康人痰液样本psr法和pcr法都为阴性结果。从这32份psr阳性痰液样本中成功分离出32株肺炎克雷伯杆菌，它们的rcsa基因测序结果与blast网站一致。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的引物组合、试剂盒和psr方法

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>44

<212>dna

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<400>1

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