一种临床级干细胞无血清培养基的制作方法

本发明涉及细胞培养用培养基，具体涉及一种临床级干细胞无血清培养基，属于生物医药领域。

背景技术：

目前的基础培养基没法支撑干细胞的长期培养，还有优化的空间。而现在更多的是研究关注补充液对干细胞的影响。在传统的干细胞培养过程中通常需要添加一定量的胎牛血清，但是胎牛血清有几个劣势：成本高、批次变异、可用性有限、血清易受病毒、支原体及其他病原体污染以及引起异种免疫反应的可能性问题，同时血清中含有大量的氨基酸、核苷、蛋白质、激素、脂类等微量成分，这些成分的含量和具体作用仍没有完全确定，血清中含有的脂类物质能够促进细胞分化。为了避免以上胎牛血清使用中的缺陷，现在开发了可替代动物血清的培养基，最常用的是人ab血清、人血小板裂解物和无血清的化学限定培养基，但是各有缺点，ab血清和人血小板裂解物均存在病毒污染的可能性，而且不同批次之间有明显的差异；人血小板裂解物释放的多种生长因子可能有抑制细胞生长的物质，以及改变细胞表面标志物表达和细胞功能等；目前化学限定培养基虽然不含血清，能避免血清制品带来的潜在风险，但是也不完美，其可促进干细胞分化，提高免疫原性，不能很好的维持干细胞的干性。因此成分确定，质量安全可控，能够大规模扩增培养干细胞且始终维持“干性”的临床级培养基是临床应用的必然选择。

技术实现要素：

针对以上缺点改进，本发明的目的是提供一种临床级干细胞无血清培养基，该培养基不含动物和人血清制品成分，同时去除影响细胞分化的脂类物质成分和合成脂类的物质成分，成分明确、质量安全可控，既提高了干细胞的正常生长和快增值能力，同时保证干细胞的纯度和干性，适合临床干细胞的大规模生产和应用。

附图说明

图1是脐带间充质干细胞传代培养中细胞培养首次达到80％融合度时的显微镜观察照片以及p10代的显微镜观察照片；

图2是脐带间充质干细胞传代培养中细胞培养首次达到80％融合度时以及p10代的流式检测结果；

图3是ips细胞复苏后首次达到80％融合度时的显微镜观察照片；

图4是ips细胞传代培养中细胞培养至p20代的显微镜观察照片。

具体实施方式

以下实施例是对本发明进一步详细说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

本实施例的一种临床级干细胞无血清培养基，以dmem-f12培养基为基础培养基，并去除dmem-f12培养基中影响细胞分化的脂类物质成分和合成脂类的物质成分：包括肌醇、亚油酸，同时含有添加成分，添加成分以及其含量（最终浓度）如下：聚乙烯醇5ng/ml、bmp-410ug/ml、维生素c40ug/ml、维甲酸1um、烟酰胺5ug/ml、阿奇霉素20ug/ml。

具体配置方法是，在配置dmem-f12培养基时，不添加肌醇和亚油酸成分，或者dmem-f12培养基用活性炭脱脂处理。在不含脂类成分和合成脂类的物质成分的dmem-f12培养基中添加上述成分，使其终浓度为以上浓度，由此得到一种临床级干细胞无血清培养基。

实施例2：

本实施例的一种临床级干细胞无血清培养基，以e8培养基为基础培养基，并去除e8培养基中影响细胞分化的脂类物质成分和合成脂类的物质成分：包括肌醇、亚油酸，同时含有添加成分，添加成分以及其含量（最终浓度）如下：聚乙烯醇10ng/ml、bmp-420ug/ml、维生素c15ug/ml、维甲酸1um、烟酰胺1ug/ml、阿奇霉素30ug/ml。

具体配置方法是，在配置e8培养基时，不添加肌醇和亚油酸成分，或者e8培养基用活性炭脱脂处理。在不含脂类成分和合成脂类的物质成分的e8培养基中添加上述成分，使其终浓度为以上浓度，由此得到一种临床级干细胞无血清培养基。

实施例3：

以实施例1中得到的一种临床级干细胞无血清培养基体外培养脐带间充质干细胞，步骤如下：

（1）脐带组织采集和分离：取足月产的健康产妇脐带一根，获取过程合法，同时乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、alt、支原体检测项目均为阴性。在gmp实验室无菌生物安全柜内进行脐带组织洗涤、消毒、去除动静脉血管和胎羊膜表皮膜组织，最后得到血管周组织及华通氏胶组织，充分剪碎成1mm3大小的组织块，用组织块贴壁法，加入实施例1制备的一种临床级干细胞无血清培养基，适当密度接种至培养皿或培养瓶中，于37℃、co2培养箱静置培养。

（2）脐带msc传代培养及观察与检测：观察有大量组织块周围有大量细胞爬出并开始逐步长满时，进行胰蛋白酶消化，吸弃胰蛋白酶加入实施例1制备的一种临床级干细胞无血清培养基，将细胞吹散，离心，去上清，加入实施例1制备的一种临床级干细胞无血清培养基，计数，调整细胞密度，并1:3的比例接种至细胞培养皿或培养瓶中，继续扩增培养。等脐带间充质干细胞首次达到80％融合度时以及传到p10代融合度达到80%时，进行显微镜观察拍照，同时收集细胞进行流式检测。图1为脐带msc首次达到80％融合度时以及传到p10代融合度达到80%时的生长状态；图2为脐带msc首次达到80％融合度时以及传到p10代融合度达到80%时的流式检测结果。

实施例4：

以实施例2中得到的一种临床级干细胞无血清培养基体外培养人ips干细胞，步骤如下：

（1）人ips细胞的复苏和扩增培养：

解冻：将从液氮中取出的第3代人ips细胞冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1～2min内快速解冻。

接种：然后1000rpm/min离心3min、重悬、接种于提前包被基质胶的6孔板中，每孔1×106cells/ml左右，每孔补全实施例2中得到的一种临床级干细胞无血清培养基2ml。

培养：接种后的6孔板/12孔板置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈4个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动6孔板/12孔板使细胞均匀分布。并置于37℃，5%co2的恒温培养箱培养，每天天观察细胞贴壁情况，当细胞融合度达到80%，拿到显微镜下观察拍照。图3是ips细胞复苏后首次达到80％融合度时的生长状态。

换液：从复苏的时间开始每24h一次的频率，更换实施例2中得到的一种临床级干细胞无血清培养基2ml。

（2）人ips细胞传代培养及观察：

清洗：当ips细胞融合度达到80%，拿出6孔板弃去旧的培养基，贴壁缓慢加入1ml/0.5mlpbs缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去pbs缓冲液；

消化：然后加入1ml人类多能干细胞无酶消化液使之覆盖皿底，并置于co2培养箱中2～5min，消化时间快结束时可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况，若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙，立刻吸掉无酶消化液停止消化，同时加入平衡好的2ml实施例2中得到的一种临床级干细胞无血清培养基，用移液枪扇形吹打培养皿底，吹吸次数保持在3～5次，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液；

接种培养：离心、重悬，根据细胞密度，每隔3-5天进行1:3或1:4传代，同上操作，接种于提前包被基质胶的6孔板中，每孔1×106cells/ml左右，每孔补全实施例2中得到的一种临床级干细胞无血清培养基2ml，并置于37℃，5%co2的恒温培养箱继续培养，每隔24h更换实施例2中得到的一种临床级干细胞无血清培养基。每天天观察细胞贴壁情况，当细胞融合度达到80%，拿到显微镜下观察拍照。图4是ips细胞传代培养中细胞培养至p20代的生长状态。