一种快速检测猴免疫缺陷病毒SIV引物、探针及其试剂盒和使用方法与流程

本发明属于实验动物的病原检测领域，具体涉及一种快速检测猴免疫缺陷病毒siv引物、探针及其试剂盒。

背景技术：

猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus，siv)是从灵长类动物体内分离出的免疫缺陷病毒，约30多种，与hiv同属于逆转录病毒科慢病毒属。siv与hiv－1有40％－50％的同源性，与hiv－2的同源性则达到60％。科学家从各种灵长类动物体内分离出不同的siv。siv在天然宿主中不致病，如果跨种族感染，动物会出现人类aids类似症状，表现为cd4+细胞进行性下降，最后并发机会性感染死亡。遗传学上主要分为sivcpz、sivsm、sivmnd、sivsyk、sivagm五大支系，siv具有宿主依赖性进化特点，从而使其在天然宿主中不致病,如sivsm感染乌黑白脸猴，sivagm感染非洲绿猴，sivcpz感染黑猩猩等都不会使后者发病，但当跨物种传播至非天然宿主,如亚洲恒河猴,通常会使其发病,正是利用的这一特点,研究人员用其感染非天然宿主建立猴艾滋病模型。目前，ncbi数据库中，能查的的siv全基因组序列有165个，分别来自不同地方的分离株。基因组结构基本相同(如下)，其中，核心蛋白gag区域在不同菌株之间有较高的相似性。

近年来，一种新颖的分子学检测方法即重组酶聚合酶等温扩增(recombinasepolymeraseamplification,rpa)方法吸引了很多研究者的关注。该方法以三种酶为基础：结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶。重组酶和特异性引物形成蛋白-引物复合物，该复合物在dna序列中寻找并定位同源序列，引物和dna同源序列之间发生链交换反应形成d-loop结构；单链dna结合蛋白随即和被置换的dna链结合防止其被再次置换，dna聚合酶识别引物进行dna链的合成，两条特异性引物即可形成为一个完成的扩增子，整个过程在恒温下完成。在相应反应体系中加入荧光探针，20分钟内即实现样品检测的目的，而且该方法的敏感性和荧光定量pcr相当，但和荧光定量pcr相比具有以下优点：反应时间更短，只需要20分钟；成本更低的恒温荧光检测仪，价格是荧光定量pcr仪的十分之一。迄今为止，以重组酶聚合酶等温扩增为基础研发的诊断方法越来越多。在动物传染病方面，已经报道的有禽流感病毒、弗朗西斯氏菌、猪伪狂犬病毒和圆环病毒等病原rpa检测方法的建立。然而猴免疫缺陷病毒相关检测还没有报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种准确性高，特异性，能快速检测猴免疫缺陷病毒siv(simianimmunodeficiencyvirus)的引物以、探针、试剂盒以及试剂盒使用方法。

为此，本发明的第一个目的是这样的：

一种检测猴免疫缺陷病毒siv的引物及探针，所述上游引物siv-f核苷酸序列如下所示seqidno：1所示；所述下游引物siv-r核苷酸序列如下所示seqidno：2所示；所述探针siv-p核苷酸序列如下seqidno：3所示。

进一步的，上述的一种检测猴免疫缺陷病毒siv的引物及探针，所述探针中下游两个相邻的t分别被用荧光基团fam和猝灭基团bhq标记，两t之间一碱基被四氢呋喃取代，3’端由c3spacer封闭。

本发明提供的第二个技术方案是这样的：

一种用于检测检测猴免疫缺陷病毒siv的试剂盒，所述试剂盒包括下述引物及探针：

所述上游引物siv-f核苷酸序列如下所示seqidno：1所示；所述下游引物siv-r核苷酸序列如下所示seqidno：2所示；所述探针siv-p核苷酸序列如下seqidno：3所示。

进一步的，上述的一种用于检测检测猴免疫缺陷病毒siv的试剂盒，所述试剂盒还包括反应所学的三种酶、缓冲液、纯化水，乙酸镁，阴性质控品。

进一步的，上述的一种用于检测检测猴免疫缺陷病毒siv的试剂盒，所述试剂盒还包括反应所需的三种酶、缓冲液、纯化水，乙酸镁，阴性质控品。

进一步的，上述的一种用于检测检测猴免疫缺陷病毒siv的试剂盒，三种所述的酶为能结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶。

进一步的，上述的一种用于检测检测猴免疫缺陷病毒siv的试剂盒，所述缓冲液为缓冲液ⅵ。

本发明提供的第三个技术方案是这样的：

上述检测猴免疫缺陷病毒siv试剂盒的的使用方法，依次包括下述步骤：

1)提取病毒rna；

2)以提取的rna为模板，用权利要求1所述的引物探针进行rt-rpa扩增；

3)在检测荧光的仪器上扩增并检测实时荧光，根据设定的阈值和ct值判读是否含有猴免疫缺陷病毒siv。

进一步的，上述检测猴免疫缺陷病毒siv试剂盒的的使用方法，所述的rt-rpa扩增方法为：

1)配置混合液

2)将步骤1)配置的混合液加入干粉状的荧光反应基础单元中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂(2s)离心将液体收集至管底，得反应单元；

3)打开步骤2)的反应单元，向每个反应单元的管盖上加入2.5μl乙酸镁，然后向各反应单元中加入2μl模板rna或阴性质控品，充分混匀并离心收集。

进一步的，上述检测猴免疫缺陷病毒siv试剂盒的的使用方法，步骤3)中在检测荧光的仪器上扩增并检测实时荧光是将反应管放入荧光基因检测仪中39℃条件下反应30min，并实时观察结果。

进一步的，上述检测猴免疫缺陷病毒siv试剂盒的的使用方法，所述的混合液包括下述组分：

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具体如下技术优点:

1)本发明提供的技术方案能够快速准确检测siv病毒，特异性强，灵敏度高，且能在30min完成检测，

2)本发明提供的技术方案能够实现闭管检测，防止气溶胶污染。

附图说明

图1是不同引物组的扩增结果图；

图2是特异性检测结果；

图3是灵敏度检测结果。

图4是临床样品rt-pcr检测凝胶电泳图。

图5是临床样品rt-rpa检测结果。

具体实施方式

下面结合结合具体实施方式和附图说明对发明的权利要求做进一步的详细说明，但不够成对本发明的任何限制。

除有特别说明，本发明中所用各种试剂、原料均为可以从市场上购买或者通过公知的方法制得的产品。

实施例1引物和探针的设计

按引物探针设计要求，设计了一条探针，3条上游引物，3条下游引物，进行9个组合的筛选，发现其中一对组合(f2/r2)检测效果最为理想(图1所示)，其碱基序列如下所示。

siv-f2：ttataatactgtctgcgtcatctggtgcattc(seqidno：1)，

siv-r2：ctgttggtctacttgtttttggcatagtttctg(seqidno：2)；

探针siv-p：

agtgaaacacactgaggaagcaaaacaga/i6famdt/a/idsp//ibhq1dt/gcagagacacctagtg(seqidno：3).

另外，筛选的引物，还包括：

siv-f1：taatactgtctgcgtcatctggtgcattcacg(seqidno：4)

siv-r1：ctgccgctagatggtgctgttggtctacttg(seqidno：5)

siv-f3：cctttataatactgtctgcgtcatctggtgc(seqidno：6)

siv-r3：tagatggtgctgttggtctacttgtttttgg(seqidno：7)

所述的探针siv-p中下游两个相邻的t分别被用荧光基团fam和猝灭基团bhq标记，两t之间一碱基被四氢呋喃取代，3’端由c3spacer封闭。

实施例2：一种快速检测猴免疫缺陷病毒siv试剂盒

本发明提供的试剂盒包括以下组分：

(1)实施例1所设计的用于分析的引物(siv-f2和siv-r2)和探针(siv-p)；

(2)rt-rpa所需的荧光反应单元的酶(能结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶)

(3)纯化水、阴性质控品、缓冲液ⅵ及激活剂醋酸镁。

实施例3快速检测猴免疫缺陷病毒siv试剂盒的使用方法

(1)质粒的构建

用天根trizol试剂提取毒株的基因组，用siv-f2和siv-r2引物对基因组进行rt-pcr扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。再用天根的试剂盒将纯化后的rt-pcr产物连接至pmd-19t载体中，将连接产物转化至dh5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌液pcr鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。

(2)质粒pcr扩增

用实施例1所述的引物及探针对含有目的片段的质粒物进行rt-rpa扩增。

1)配置混合液

2)将上述混合液加入干粉状的荧光反应基础单元中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心将液体收集至管底。

3)打开上述反应单元，向每个反应单元的管盖上加入2.5μl乙酸镁，然后向各反应单元中加入2μl无菌纯水稀释(采用的稀释液)至10^3copies/μl质粒或阴性质控品，充分混匀并离心收集。

4)将反应管放入荧光基因检测仪中39℃条件下反应30min，并实时观察结果。

结果判断标准(注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整)如下：

最低检测荧光阈值>200，ct值<20。

待测样本的分析判断：1)当待测样本的荧光值＞200，且cutoff值<20时，判断为阳性样本；2)否则，判断为阴性：3)若刚好在临界值附近，需要进行重复实验或采取其他使用方法进一步验证。

为了证明本发明提供的技术方案的优点，下面给出猴免疫缺陷病毒siv的rt-rpa试剂盒的灵敏性实验。

将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至10¹copies/μl，用上述建立的siv的rt-rpa方法进行检测。该方法检测灵敏性实验结果如图3所示，实验结果表明，该方法检测灵敏度为10²copies/ul。

实施例5：猴免疫缺陷病毒siv的rt-rpa使用方法的特异性检测

采用建立的siv的rt-rpa检测方法，以siv阳性参照，对猴d型逆转录病毒(srv)、猴t淋巴细胞趋向性病毒(stlv)、猴泡沫病毒(sfv)、猴麻疹病毒(mev)和猴结核分支杆菌(mtb)进行检测，结果除阳性参照为阳性外，其他病毒均为阴性，表明建立的方法具有良好的特异性。

实施例6：猴免疫缺陷病毒siv的rt-rpa检测方法检测临床样品

从猴场采集的15例血液样本中，提取病毒rna，然后用建立的siv的rt-rpa使用方法进行检测，同时用rt-pcr方法进行比对检测。结果两种方法检测结果一致，均检出3例阳性，表明本发明建立的rt-rpa检测准确率高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东省实验动物监测所

<120>一种快速检测猴免疫缺陷病毒siv引物、探针及其试剂盒和使用方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>simianimmunodeficiencyvirus

<400>1

ttataatactgtctgcgtcatctggtgcattc32

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>simianimmunodeficiencyvirus

<400>2

ctgttggtctacttgtttttggcatagtttctg33

<210>4

<211>45

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<210>5

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<212>dna

<213>simianimmunodeficiencyvirus

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<210>6

<211>31

<212>dna

<213>simianimmunodeficiencyvirus

<400>6

cctttataatactgtctgcgtcatctggtgc31

<210>7

<211>31

<212>dna

<213>simianimmunodeficiencyvirus

<400>7

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