本发明属于微生物发酵技术领域，具体属于一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法。
背景技术：
现有技术中，三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素时，通常采用添加氧载体、表面活性剂、前体物质等各种发酵促进剂的方式来提高β-胡萝卜素的发酵产量，然而在发酵过程中添加上述物质的缺陷在于，上述发酵促进剂购置成本一般较高，同时部分促进剂对于发酵菌种具有毒害性。
技术实现要素：
针对以上技术问题，本发明目的在于提供一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法，利用三孢布拉氏霉菌进行液体深层发酵，来生产β-胡萝卜素，通过添加外源性促进剂乙烯利，刺激微生物大量富集代谢产物提高β-胡萝卜素的产量，成本低、安全无毒。
本发明所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法，具体包括如下步骤：
(1)平板培养：三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于pda平板培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存，得到三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株平板；
(2)种子培养：从三孢布拉氏霉菌菌株平板中各自用接种环挑取一环菌丝体，接种到有种子培养基的锥形瓶中，用棉塞封口后，于26-28℃，转速为200-220rpm条件下避光培养48h，得种子液；
(3)微生物发酵生产β-胡萝卜素：将培养好的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％体积的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于26-28℃，200-220rpm条件下避光振荡培养84小时；发酵24-42小时后将乙烯利溶液溶液加入到发酵培养基中，继续培养，得发酵培养液；
(4)β-胡萝卜素的提取：用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤，将湿菌体置于真空干燥箱中，干燥处理24小时得到干菌体；干菌体破碎，用乙醇萃取，旋转蒸发仪上真空蒸馏乙醇，获得β-胡萝卜素的纯品。
步骤(1)中pda平板培养基的制备方法如下：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min，配制pda培养基。
步骤(2)中种子培养基的制备方法如下：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min，冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素b1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调ph至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
步骤(3)中发酵培养基的制备方法如下：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调ph至7.5，分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min所得。
步骤(3)中乙烯利溶液溶液的浓度为0.5％-2％。
步骤(3)中乙烯利溶液溶液的加入量为1-4ml。
步骤(3)中所述的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液的比例1：4(v/v)。
步骤(4)中所述的真空干燥箱中真空干燥的工艺条件为，温度为45℃、压力为0.08mpa。
步骤(4)中乙醇为无水乙醇，萃取时萃取3次及以上。
本发明的原理为：本发明在利用三孢布拉氏霉菌进行液体深层发酵时，添加一定浓度的乙烯利溶液，乙烯利缓慢释放出乙烯，乙烯在转录水平上对类胡萝卜素合成相关基因起到促进作用，从而促进了β-胡萝卜素的大量积累，提高β-胡萝卜素的发酵产量。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果。
(1)本方法成本低廉、操作简便、效果明显，可以取代通过添加氧载体、表面活性剂、前体物质等各种发酵促进剂来提高β-胡萝卜素的产量，避免了其它发酵促进剂价格太高和对菌种的毒害性，为工业化生产提供了良好的依据；
(2)本发明β-胡萝卜素产量比空白对照组提高54％-78％，同时发酵周期由原来的5天缩短为了3天，缩短了40％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min，配制pda培养基。取三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于pda平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存。
(2)种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素b1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调ph至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(3)发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调ph至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(4)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于28℃，转速为200-220rpm条件下避光培养48小时。
(5)发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％(v/v)的接种量分别接入到装3个有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，在发酵开始36小时，准确量取2、3、4ml的1％的乙烯利溶液，分别加入到上述3个发酵培养基中，标记。于28℃，转速为200-220rpm条件下避光培养。
(6)β-胡萝卜素的提取：发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08mpa条件下干燥处理24小时，得到干菌体。干菌体用粉粹机破碎，用无水乙醇三次及以上萃取，然后旋转蒸发仪上真空蒸馏乙醇，获得β-胡萝卜素的纯品。
所得结果如下：
空白组(空白组发酵工艺与本实施例不同点在于，空白组未加入乙烯利溶液)β-胡萝卜素产量为520mg/l发酵液。
添加2ml的1％乙烯利时，β-胡萝卜素产量为801mg/l发酵液，比空白提高了54％。
添加3ml的1％乙烯利时，β-胡萝卜素产量为915mg/l发酵液，比空白提高了76％。
添加4ml的1％乙烯利时，β-胡萝卜素产量为878mg/l发酵液，比空白提高了69％。
实施例2
(1)平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min，配制pda培养基。取三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于pda平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存。
(2)种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素b1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调ph至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(3)发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调ph至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(4)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于28℃，转速为200-220rpm条件下避光培养48小时。
(5)发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％(v/v)的接种量分别接入到3个装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中。在分贝发酵培养了24、36、42小时后，将3ml的1％的乙烯利分别加入上述3个发酵培养基中标记。于28℃，转速为200-220rpm条件下避光培养。
(6)β-胡萝卜素的提取：发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08mpa条件下干燥处理24小时，得到干菌体。干菌体用粉粹机破碎，用无水乙醇三次及以上萃取，然后旋转蒸发仪上真空蒸馏乙醇，获得β-胡萝卜素的纯品。
所得结果如下：
空白(空白组发酵工艺与本实施例不同点在于，空白组未加入乙烯利溶液)β-胡萝卜素产量为550mg/l发酵液。
发酵开始后24小时添加3ml的1％的乙烯利，β-胡萝卜素产量为847mg/l发酵液，比空白提高了54％。
发酵开始后36小时添加3ml的1％的乙烯利，β-胡萝卜素产量为979mg/l发酵液，比空白提高了78％。
发酵开始后42小时添加3ml的1％的乙烯利，β-胡萝卜素产量为775mg/l发酵液，比空白提高了41％。