固氮的甲基杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物学领域，特别是涉及一种固氮的甲基杆菌菌株及其应用。

背景技术：

植物在生长过程中与各种微生物之间发生着相互作用，主要包括植物根际微生物、叶际微生物以及植物内生菌。这些微生物可以通过固氮、解磷、分泌生长素、增加植物抗性等直接或间接的方式促进植物生长。在农业生产中，通过外源接种这类有益微生物不仅可以促进植物生长，增加作物产量，同时，其对环境友好性和作用效果的可持续性，在对生态环境越来越重视的当代农业中备受推崇。

甲基杆菌属(methylobacterium)是一类兼性需氧型细菌，能够利用包括甲醇、甲胺等一碳类化合物作为碳源。甲基杆菌属细菌菌体因能够合成类胡萝卜素而呈粉红色，因此又将这一类细菌称为粉红色兼性甲基营养菌(pink-pigmentedfacultativemethylotrophics，ppfm)。methylobacterium广泛存在于土壤、空气、水域等环境，以及植物的叶际和根际中，具有能够产生植物激素、拮抗植物病原微生物、缓解非生物逆境等功能，在农业生产中具有较大的开发利用价值。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的是提供一种新的甲基杆菌yt2019b002，其可有效固氮。

具体技术方案如下：

一种甲基杆菌yt2019b002，所述甲基杆菌yt2019b002的保藏编号为gdmccno:61052。

本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌yt2019b002在生物固氮中的应用。

本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌yt2019b002在提高土壤氮含量中的应用。

本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌yt2019b002在制备土壤调理剂中的应用。

本发明的另一目的是提供一种生物制剂，其活性成分包括上述的甲基杆菌yt2019b002。

本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌yt2019b002的培养方法，包括以下步骤：将甲基杆菌yt2019b002接种于培养基中，于20～30℃条件下进行培养。进一步地，于22～28℃条件下进行培养；更进一步地，于24～26℃条件下进行培养。

在其中一些实施例中，所述培养基为ams培养基。

本发明所述的甲基杆菌yt2019b002(methylobacteriumsp.)已于2020年6月9日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心(简称：gdmcc，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏日期：2020年6月9日，保藏编号：gdmccno:61052。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现了一种属于甲基杆菌属的新微生物甲基杆菌yt2019b002，其可以进行生物固氮，在农业生产中具有广泛的开发利用价值。

附图说明

图1为菌株yt2019b002在培养基上的培养形状和革兰氏染色图(a：ams培养基上培养形状；b：革兰氏染色)；

图2为特异性引物(mxaf基因)pcr扩增结果凝胶电泳图，(m：dl2000marker；1,2：yt2019b002菌株；3,4：阴性对照)；

图3为基于16srrna序列采用邻接法(neighbor-joining，nj)构建的系统发育树；菌株escherichiacoli562(j01859)为外群，^t：模式菌株；

图4为菌株yt2019b002固氮能力平板测定(a：ck正常ams培养基；b：不含nh4cl的缺氮ams培养基)。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

材料与方法：

分离材料来源：分离材料果蔗苗(saccharumofficinarum‘badila’)采自于广东省广州市南沙区东涌镇，采集后冰盒低温保藏带回实验室，置于-20℃低温保藏，用于功能微生物分离。

固体ams培养基：根据whittenburyetal.1970中甲基杆菌属细菌专性培养基ammoniummineralsalt(ams)培养基，主要成分包括k2hpo40.7g，kh2po40.54g，mgso4·7h2o1.0g，caci2·2h2o0.2g，feso4·7h2o4mg，nh4cl0.5g，znso4·7h2o100.0mcg，mncl2·4h2o30.0mcg，h3bo3300.0mcg，cocl2·6h2o200.0mcg，cucl2·2h2o10.0mcg，nicl2·6h2o20.0mcg，na2moo4·2h2o60.0mcg，agar15.0g，蒸馏水1l，ph值6.8，121℃灭菌30min备用，灭菌后带培养基冷却至50-55℃，每100ml培养基加入1ml过滤灭菌的甲醇，混匀后倒平板备用。

分离方法：将甘蔗根际土通过梯度稀释法制备得到10^-6-10^-8g/ml的土壤悬液，将悬液均匀涂布于固体ams培养基上，25℃恒温倒置培养，观察并分离纯化产生粉红色色素的菌株，命名为yt2019b002，将菌株接入营养肉汤液体培养基中，25℃160rpm摇培48h后，以1:1的体积比加入30％甘油水溶液(v/v)，于-80℃保存菌株，备用。

菌株yt2019b002的鉴定：

1.菌株yt2019b002的理化性质测定

将菌株yt2019b002在大豆酪蛋白琼脂培养基tsa(oxoid)固体培养基上25℃划线培养5天后，挑取单菌落进行革兰氏染色，利用2systems革兰氏阴性菌鉴定卡(gn卡)进行碳源利用、酶类活性和耐药性检测。

2.菌株yt2019b002的分子生物学鉴定

用热裂解法提取yt2019b002单菌落dna，利用特异性引物mxaf1003(5-gcggcaccaactggggctggt-3′，seqidno:2)和mxar1561(5-gggcagcatgaagggctccc-3′，seqidno:3)进行mxaf基因扩增，确认菌株属的种类。同时，利用27f(5'-agagtttgatcmtggctcag-3'，seqidno:4)和1492r(5'-tacggytaccttgttacgactt-3'，seqidno:5)进行16srrna片段扩增，pcr产物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列通过与相近物种的序列构建系统发育树对yt2019b002准确种类进行鉴定。

菌株yt2019b002酶活测定

菌株固氮活性测定：将菌株接种于没有氮源(nh4cl)的ams固体培养基上培养，以加入nh4cl的正常ams培养基为对照，划线法接入细菌，28℃恒温倒置培养7天，观察菌株生长情况，每个处理3个重复。

葡聚糖酶活性测定：将菌株划线接种于km培养基上，主要成分包括0.4％(nh4)2so4，0.01％naci，0.01％mgso4，0.01％caci2，0.05％酵母提取物，33mgfe(iii)-edta，0.05m磷酸钾缓冲液(ph7.0)，0.04％羧甲基纤维素钠(cmc)，agar15.0g，蒸馏水1l，121℃灭菌30min。30℃恒温倒置培养3天后，将平板中倒入0.1％刚果红溶液染色30min，1mnaci溶液褪色10min，观察是否有透明圈产生。

嗜铁素活性测定：参照shinetal.(2001)的方法。a：①60.5mg铬天青s溶于50ml去离子水；②10ml三价铁溶液(1mmfecl3·6h2o，10mm盐酸为溶剂)；③72.9mgctab溶于40ml去离子水。上述三个溶液混合定容至100ml，ph调至中性，121℃灭菌20min。b：30.24gpipes加入900ml水琼脂培养基，ph＝6.8，121℃灭菌20min。a、b液混合倒平板，接菌30℃恒温倒置培养3d后观察、记录结果。

acc活性测定：参照penrose和glick(2003)的方法，将菌株接入装有10mlams液体培养基的50ml三角瓶中，28℃120rpm摇培4-5天，3000g离心5min收集菌体，用过滤灭菌的0.1mtris-hci(ph7.5)清洗菌体两次，然后重悬于1ml0.1mtris-hci(ph7.5)中，取200μl涂布于以3mmacc为唯一氮源的df微量元素培养基中，以加入(nh4)2so4(0.2％w/v)的df培养基为阳性对照，涂布好的培养皿放置于28℃恒温倒置培养3d后观察菌株生长状况。

结果：

1.鉴定

菌株yt2019b002革兰氏染色呈红色(如图1)，为革兰式阴性菌。菌落形态：在ams固体培养基上菌落为不透明浅粉色，菌落直径1-3mm，向上突起，边缘整齐，干燥。

理化性质特征测定如表1，利用2system与2厌革兰氏阴性菌鉴定卡(gn)，通过对一共47种碳源利用、酶类活性和耐药性及一个阴性对照反应的测定，初步鉴定yt2019b002为甲基杆菌属(methylobacteriumsp.)细菌。

表1.菌株yt2019b002理化性质特征

注：+＝95％至100％阳性；v＝6％至94％阳性；-＝0％至5％阳性。

以菌株yt2019b002的dna为模板利用methylobacterium属特异性引物进行扩增，获得片段大小为560bp的特异性条带(图2)，进一步确认yt2019b002为甲基杆菌属细菌。将菌株yt2019b002的16srrna序列(如seqidno：1所示)与ncbi数据库里的序列进行比对，其与m.populi模式菌株bj001(accessionno.：ay251818)的相似度最高，达到99.49％。以ncbi中methylobacterium属其他种的16srrna序列为参照，以escherichiacoli(accessionno.:j01859)为外群，采用邻接法(neighbor-joining，nj)构建系统发育树，得到的最优树中菌株yt2019b002与m.populi(ay251818)以高支持率(96)形成了一个独立分支(如图3)。

本发明所述的甲基杆菌yt2019b002的16srrna基因序列如seqidno：1所示：

seqidno:1：

cagcttacacatgcagtcgaacgggcttcttcggaagtcagtggcagacgggtgagtaacacgtgggaacgtgcccttcggttcggaataactcagggaaacttgagctaataccggatacgcccttatggggaaaggtttactgccgaaggatcggcccgcgtctgattagcttgttggtggggtaacggcctaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctcttttgtccgggacgataatgacggtaccggaagaataagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctcggaatcactgggcgtaaagggcgcgtaggcggccgattaagtcgggggtgaaagcctgtggctcaaccacagaattgccttcgatactggttggcttgagaccggaagaggacagcggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtccggttctgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgccagccgttggcctgcttgcaggtcagtggcgccgctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcaraaacctwaccatccccttgacatggcatgttacctcgagagatcggggatcctcttcgraggcgtgcacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccacgtccttagttgccatcattcagttgggcactctagggagactgccggtgataagccgcgaggaaggtgtggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggatgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggacgcgaaaccgcgaggttgagcaaatccccaaaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgggtgcatgaaggcggaatcgctagtaatcgtggatcagcacgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtcttacccgacggcgctgcgccaaccgcaagggggcaggcgaccacggtagtcgcac。

2.固氮能力测定

通过对与促生作用相关的主要活性测定结果显示，菌株yt2019b002能在缺氮源的ams培养基上生长(图4)，且与以nh4cl为氮源的正常ams培养基上的菌落生长无明显差异，由此可知，菌株yt2019b002具有固氮的能力。

yt2019b002在以acc为唯一氮源的df培养基上不能生长，并且通过平板测定也没有葡聚糖酶和嗜铁素活性。

综上，菌株yt2019b002可以进行生物固氮。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

sequencelisting

<110>广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）

<120>固氮的甲基杆菌菌株及其应用

<130>2020-08-05

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