一种荧光检测分子印迹聚合物及其用途和检测试剂盒的制作方法

本申请涉及分子印迹荧光检测技术领域，尤其涉及一种基于下转换核壳纳米晶材料的荧光检测分子印迹聚合物及其在甲胎蛋白检测中的用途和检测试剂盒。

背景技术：

甲胎蛋白(afp)在临床上对于肝癌检测和追踪来说，是一种非常可靠有效的肿瘤标志物。尤其，对甲胎蛋白的分析也给我们能及时检测到病情的发展状况以及病人对于治疗的结果，提供了一个很好的机会。通常情况下，健康人体内甲胎蛋白的含量低于25ng/ml，如果成人体内血清中甲胎蛋白的含量升高，即可视为不正常。所以科学研究者不断地研究新方法并将其应用在对甲胎蛋白的检测上。

荧光检测方法由于其响应速度快，灵敏度高，已成功用于蛋白质分析。然而，荧光生物传感系统常常受到可能影响荧光强度的共存物质的干扰。分子印迹聚合物是一种通过以特定的目标分子为模板，制备具有与模板分子互补的预定结合位点的人造受体，具有高选择性。分子印迹聚合物还具有稳定性高，亲和力强，易于制备等显著的优点。目前，分子印迹聚合物已被应用于抗体模拟物，固相萃取，化学/生物传感和药物输送等方面。

近年来，荧光型分子印迹聚合物因其灵敏度高，选择性高，取样少，操作简便等特点，成为蛋白质检测领域的研究热点。常用于制备荧光型分子印迹聚合物的荧光材料有有机染料和量子点。但有机染料光稳定性较差并具有潜在的毒性。量子点由于其良好的光学性能和较高的化学稳定性，已经成为制备荧光分子印迹聚合物最广泛使用的荧光材料之一。尽管基于量子点的分子印迹聚合物具有高光学效率和低检测限，但量子点仍然存在固有的潜在毒性和环境危害性。因此，开发生态友好的新型荧光型分子印迹是目前发展趋势之一。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种基于下转换核壳纳米晶材料的分子印迹聚合物，与血液中的甲胎蛋白能够发生特异性结合，导致纳米晶荧光猝灭，且荧光强度变化与甲胎蛋白的浓度密切相关，通过拟合纳米晶荧光强度和甲胎蛋白浓度的关系曲线，能够很好的应用于甲胎蛋白的定量检测，具有生物相容性好、选择性高、快响应、非接触式与高准确度的优势。

为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种基于下转换核壳纳米晶材料的分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物的分子式如下：cas:na/ce/eu@srs:ce/mn@mip，以cas:na/ce/eu@srs:ce/mn纳米晶为载体，3-氨基丙基三乙氧基硅烷为功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，甲胎蛋白为模板分子制备而成。

优选，所述纳米晶材料为水溶性纳米晶材料，由柠檬酸配体包覆cas:na/ce/eu@srs:ce/mn纳米晶构成。

优选，所述cas:na/ce/eu@srs:ce/mn纳米晶为cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn。

优选，所述纳米晶的制备方法步骤如下：

1)0.65毫摩尔乙酸钙，0.1毫摩尔乙酸钠，0.2毫摩尔乙酸铈，0.05毫摩尔乙酸铕，10毫升油酸和25毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于120℃搅拌并保温40分钟，然后迅速升温至230℃，并保温1小时；

2)待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和环己烷的混合液洗涤3-5次，并将获得的核纳米晶分散在4毫升环己烷溶液中备用；

3)0.74毫摩尔乙酸锶，0.2毫摩尔乙酸铈，0.06毫摩尔乙酸锰，8毫升油酸和15毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于120℃搅拌并保温40分钟，然后冷却至40℃，加入核纳米晶，并在于80℃搅拌并保温60分钟，然后迅速升温至230℃，并保温1小时；

4)待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和环己烷的混合液洗涤3-5次，即可获得核壳纳米晶；

5)纳米晶表面处理：将10-100mg油性氟氯化物纳米晶分散在1-3ml乙醇与0.2mol/lhcl0.5-1ml的混合液中，将混合液超声5-10min，加入0.5毫摩尔柠檬酸，室温搅拌24-48小时，然后加入乙醇洗涤、离心以及烘干等处理后即可获得柠檬酸包覆的水性纳米晶。

进一步，本申请提供了一种基于下转换核壳纳米晶材料的分子印迹聚合物的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1)取100μl氨水溶液和100μl四乙氧基硅烷加入到20ml水性纳米晶溶液中，在室温下搅拌1h，然后将20mg甲胎蛋白和80μl3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入到上述混合液中，室温下搅拌2h；

2)将所得产物进行离心分离，获得固体产物，用1mnacl溶液反复洗涤，直到上清液中检测不到模板蛋白，最后将分子印迹聚合物在60℃真空干燥8h。

进一步，本申请提供了所述的分子印迹聚合物在血液中甲胎蛋白荧光检测中的应用。

进一步，本申请提供了一种血液中甲胎蛋白荧光检测试剂盒，该试剂盒包括所述的分子印迹聚合物。

本文首先通过核壳结构设计与表面配体修饰，制备出柠檬酸包覆的cas:na/ce/eu@srs:ce/mn核壳纳米晶，然后以该纳米晶为载体，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)为功能单体，四乙氧基硅烷(teos)为交联剂，甲胎蛋白为模板分子制备出cas:na/ce/eu@srs:ce/mn@mip分子印迹聚合物。在紫外光激发条件下，当加入甲胎蛋白后，该分子印迹聚合物能够特异性选择结合甲胎蛋白，导致发光强度显著减弱，且减弱的幅度与甲胎蛋白浓度密切相关，能够很好的应用于甲胎蛋白的荧光检测。

附图说明

图1(a)和(b)分别为产物的xrd图谱和透射电子显微镜图。

图2(a)cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn核壳纳米晶在紫外激发条件下的下转换发射谱，(b)eu³⁺的荧光强度随eu³⁺离子掺杂浓度的变化曲线，(c)mn²⁺的荧光强度随mn²⁺离子掺杂浓度的变化曲线，(d)cas:20ce/5eu与cas:10na/20ce/5eu核纳米晶的荧光光谱图。

图3cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip和cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@nip的荧光强度随孵育时间的变化曲线。

图4cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip的荧光强度随甲胎蛋白浓度变化的曲线。

图5cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip和cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@nip对甲胎蛋白，前白蛋白(pa)，球蛋白(igg)，血红蛋白(hgb)吸附性能。

具体实施方式

1实验部分

1.1主要仪器和试剂：乙酸钙(99.0％)，乙酸钠(99.0％)，乙酸铈(99.9％)，乙酸铕(99.9％)，乙酸锰(99.0％)，硫粉，油酸(90.0％)，十八烯(90.0％)，甲胎蛋白，前白蛋白(pa)，球蛋白(igg)和血红蛋白(hgb)购买于sigma-aldrich公司，柠檬酸，环己烷，无水乙醇和浓盐酸购买于国药集团化学试剂有限公司，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)，四乙氧基硅烷(teos)和氨水溶液(nh3·h2o)购自长沙化学试剂公司。

1.2cas:na/ce/eu@srs:ce/mn核壳纳米晶的制备

以cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn核壳纳米晶为例，0.65毫摩尔乙酸钙，0.1毫摩尔乙酸钠，0.2毫摩尔乙酸铈，0.05毫摩尔乙酸铕，10毫升油酸和25毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于120℃搅拌并保温40分钟，然后迅速升温至230℃，并保温1小时。待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和环己烷的混合液洗涤3-5次，并将获得的核纳米晶分散在4毫升环己烷溶液中备用。

0.74毫摩尔乙酸锶，0.2毫摩尔乙酸铈，0.06毫摩尔乙酸锰，8毫升油酸和15毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于120℃搅拌并保温40分钟，然后冷却至40℃，加入核纳米晶，并在于80℃搅拌并保温60分钟，然后迅速升温至230℃，并保温1小时。待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和环己烷的混合液洗涤3-5次，即可获得核壳纳米晶。

不同浓度或种类的离子掺杂样品，通过改变前驱溶液中相应的离子浓度或种类来实现。

纳米晶表面处理：将10-100mg油性氟氯化物纳米晶分散在1-3ml乙醇与hcl(0.2mol/l,0.5-1ml)的混合液中，将混合液超声5-10min，加入0.5毫摩尔柠檬酸，室温搅拌24-48小时，然后加入乙醇洗涤、离心以及烘干等处理后即可获得柠檬酸包覆的水性纳米晶。

1.3cas:na/ce/eu@srs:ce/mn@mip分子印迹聚合物的制备

取100μlnh3·h2o(25％，w/v)和100μlteos加入到20ml水性纳米晶溶液中，在室温下搅拌1h，然后将20mgafp和80aptes加入到上述混合液中，室温下搅拌2h；将所得产物进行离心分离，获得固体产物，用1mnacl溶液反复洗涤，直到上清液中检测不到模板蛋白，最后将分子印迹聚合物在60℃真空干燥8h。

在不加入模板分子，其他条件相同的情况下，制备非印迹聚合物(cas:na/ce/eu@srs:ce/mn@nip)。

1.4表征仪器和方法

x射线衍射图谱(brukerd8advance，cu-kα)，透射电子显微镜(tem,feitecnaig2f20)，光谱仪(flurohub-b,horibajobinyvon)，功率为50w的紫外灯。x射线衍射样品的制备：将烘干的纳米晶铺满样品支架的凹槽；

透射电子显微镜样品的制备：将每次合成的全部纳米晶溶于4毫升乙醇溶液中，超声5分钟后，滴3-6滴液体于超薄碳膜上。

甲胎蛋白检测方法：将cas:na/ce/eu@srs:ce/mn@mip分子印迹聚合物溶于水溶液中，分成若干份，加入不同浓度的甲胎蛋白，在紫外激发条件下，表征产物的下转换发光性能，并拟合分子印迹聚合物的荧光强度随甲胎蛋白浓度变化的关系曲线。

1.5血液样品检测

以正常成年人血液作为实际样品，首先用磷酸缓冲液(pbs，0.2m，ph8.0)将人血液稀释至100倍(v/v)，在室温下静置。然后将20mgcas:na/ce/eu@srs:ce/mn@mip加入到8ml已经稀释后的血液样品中，震荡吸附15min。用荧光光谱仪检测其荧光强度。采用加标回收法进一步验证cas:na/ce/eu@srs:ce/mn@mip的实际应用能力，加标浓度分别为0.5，1.0，1.5ng/ml，总体积控制为8ml。

2.数据分析与讨论

cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn纳米晶的x射线衍射图谱如图1a所示，所有衍射峰均与标准pdf卡片jcpds08-0464号一一对应，且无多余的衍射峰，表明我们得到的产物为纯立方相。透射电子显微镜分析结果表明产物为均匀的立方形块状，分散性很好。需要说明的是，表面修饰后的纳米晶晶体结构没有发生改变。

在紫外光激发条件下，产物在绿光(中心波长约为548nm)和红光区域(中心波长包含596nm和620nm)表现出很强的下转换发光(图2a)，绿光对应于mn²⁺离子⁴t1→⁶a1的跃迁，红光对应于eu³⁺离子⁵d0→⁷ij的跃迁。随着核中eu³⁺离子浓度从2增到5mol％，激活离子对来源于ce³⁺离子能量传递的几率增大，因此发光强度显著增强，当eu³⁺离子浓度超过5mol％，eu³⁺离子之间的无辐射交叉弛豫几率增大，导致发光强度下降(图2b)。壳层中mn²⁺离子的最佳掺杂浓度为6mol％(图2c)。以上发光过程有如下几点说明：1.ce³⁺离子为敏化离子，吸收入射光子后，通过能量传递过程填充eu³⁺离子和mn²⁺离子的激发态能级，他们的激发态电子跃迁至基态时产生发光；2.由于eu³⁺离子和mn²⁺离子分别在核纳米晶与壳层中，两者之间的无辐射交叉弛豫过程几率较小。此外，在核中掺杂na⁺离子，不仅能有效的增强eu³⁺离子的发光，还有助于核壳结构的形成(图2d)。

图3显示了cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip和cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@nip对afp荧光检测的响应时间。在cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip溶液中加入afp，观察到荧光强度降低，并在15分钟后荧光强度保持稳定。相比之下，cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@nip的荧光强度以较快的速度下降，在孵育12分钟后达到恒定值。这归因于cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@nip对afp的吸附是表面的非特异性吸附。因此，选择15分钟作为实验的最佳响应时间。

如图4所示，在afp浓度范围为0-80ng/ml时，随着afp的浓度增加，cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip的荧光强度逐渐降低，且cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip的荧光强度与afp的浓度之间存在线性关系，相关系数为0.9808，公式为y＝-24.021x+120079。

为了评估cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip的选择性，用浓度为10ng/ml的afp，前白蛋白(pa)，免疫球蛋白(igg)和血红蛋白(hgb)溶液进行吸附研究。如图5所示，afp对ca0.2sr0.8er3f11@mip的荧光猝灭远远高于pa，igg和hgb，并且对cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@nip荧光影响不大。pa，igg和hgb对cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip和cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@nip的荧光强度影响相近。结果表明，cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip对afp的选择性很强。cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip的高特异性可能是由于印迹聚合物中的印迹孔穴只适合于模板分子afp。因此，其他类似物不能被紧紧地束缚在印迹孔穴内。

可再生性是评价cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip的实际应用价值中的一个重要参数。使用相同批次的cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip研究其在afp溶液(10ng/ml)和100倍稀释的血液中的吸附和解吸附后的荧光强度。结果表明经过5次循环后cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip分别保持了原始荧光强度的98.5％和97.2％，这表明cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip具有了良好的回收效率。重现性对于cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip的实际应用价值也是重要的指标。重复性实验是通过使用五个不同时间通过相同过程制备的cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip来进行的。通过对每个批次制备的cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip进行三次平行测定，结果显示cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip具有令人满意的重现性，rsd小于2.6％。

为了验证cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip从实际样品中灵敏检测目标蛋白质的实际应用能力，100倍稀释度正常成年人血液作为实际样品。首先通过hplc和cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip检测100倍稀释度中的afp浓度，结果分别为0.11±0.02ng/ml和0.12±0.01ng/ml。结果相近表明cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip可用于检测afp。如表1所示，血液中afp的回收率范围为进一步说明cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn@mip成功应用于生物样品中afp的检测。

表1100倍稀释正常成年人血液中afp的分析结果(n＝5)

3.结论

我们通过共沉淀法制备出油性cas:10na/20ce/5eu@srs:20ce/6mn核壳纳米晶，再通过盐酸处理以及柠檬酸配体修饰得到分散性好的水溶性纳米晶，然后将其作为载体，aptes为功能单体，teos为交联剂，通过溶胶凝胶法成功制备新型荧光印迹聚合物。在紫外光激发条件下，能够产生明亮的下转换发光。在分子印迹聚合物溶液中加入甲胎蛋白后，发光强度减弱，降低的幅度与加入的甲胎蛋白的浓度有关，甲胎蛋白浓度越高，荧光强度下降幅度越大，并且在一定浓度范围内存在良好的线性关系，能够很好地应用于甲胎蛋白的定量检测。这种荧光检测法具有生物相容性好、选择性高、准确度高以及响应快等优势。

以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。