藻体，使得藻 体充分成粉末状为止。分别取lml无水乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司）上下重悬藻 粉，4°C静置lh，使其充分溶解。4°C，52000g，离心lOmin，分别取lml上清过滤膜（0. 22ym， 上海兴亚净化材料），4°C保存备用。
[0030] 4、岩藻黄素含量测定
[0031] 精确称取0.lmg的岩藻黄素标准品（宁波大学海洋生物工程重点实验室， 取自铜藻），取lml无水乙醇，通过倍比稀释的方法对其稀释。利用高效液相色谱 (2695SeparationsModule，Waters)，以 90% 甲醇 30min，100% 甲醇lOmin，90% 甲醇持续 15min的程序在445nm处监测岩藻黄素。
[0032]本实验所使用的色谱柱型号为 250X4. 6mml，D.S-5ym，12nm，AA12S05-2546WT， No. 0425057734，Waters。通过积峰面积与浓度做出回归曲线。分别取10y1备用提取物经 HPLC检测并得到岩藻黄素积峰面积。根据回归曲线得出各组三角褐指藻细胞内岩藻黄素含 量。
[0033] 二、应用实施例
[0034] 实施例1乙酰水杨酸对三角褐指藻的影响
[0035] 利用00_的光吸收值来测定单位体积培养液中三角褐指藻细胞数量，每天定时测 定三角褐指藻的吸光值并根据回归方程得到经不同浓度的乙酰水杨酸处理三角褐指藻研 宄其对细胞生长的影响。
[0036] 如图1所示：随着培养时间的延长，各组三角褐指藻的生长均处于先上升后下降 的趋势。三角褐指藻生长的3个时期很明显，即培养的l-3d，藻体处于对数生长期，从第3d 后一直到第6d藻体的生长速度明显减慢，该时期可以认为藻体处于平台期，从第6d起一直 到培养结束，藻体的生物量一直处于下降的趋势，该时段应该为藻体的衰亡期。因此，第6d 为平台期末，该时段的生物量达到最大值。从第6d的各组三角和指藻的细胞密度看，无论 是高浓度的乙酰水杨酸（50-100mg/L)还是低浓度的乙酰水杨酸（10-25mg/L)处理三角褐 指藻，对照组的藻体细胞密度均比它们高。再者，各组浓度的乙酰水杨酸处理的三角褐指藻 生长曲线之间都非常紧密，其藻体的细胞密度在第6d时没有很大的差异。
[0037] 实施例2
[0038] 设1组为对照组，4组为实验组。对照组不做任何处理，4组实验组分别加入不同 浓度的乙酰水杨酸，其浓度分别为l〇mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L。以上述的培养条件同 等培养实验组和对照组三角褐指藻。
[0039] 对倍比稀释的岩藻黄素标准品通过HPLC的积峰面积和稀释浓度，得出回归方程： y= 0. 1074X+0. 0138,R2= 0. 9999,式中y为积峰面积，x为浓度，R2为直线方程的相关系 数。通过HPLC测定不同浓度乙酰水杨酸处理三角褐指藻细胞岩藻黄素峰面积，再根据回归 方程得出实验组和对照组三角褐指藻细胞岩藻黄素含量变化。
[0040] 如图2和表1所示：随着乙酰水杨酸浓度的不断上升，三角褐指藻细胞岩藻黄素含 量呈先上升后下降的趋势。在低浓度的乙酰水杨酸（l〇mg/L，25mg/L)处理下，藻细胞岩藻 黄素含量显著升高，其中，浓度为l〇mg/L的乙酰水杨酸处理三角褐指藻后藻细胞岩藻黄素 含量最高，为1.83mg/gDW，比对照组岩藻黄素含量的提高了 129%。当乙酰水杨酸浓度达 到25mg/L时岩藻黄素含量为1.73mg/gDW，比对照组提高了 116%。三角褐指藻在高浓度 乙酰水杨酸（50mg/L-100mg/L)处理下，其细胞岩藻黄素含量与对照组的含量大致持平。
[0041] 表1不同浓度的乙酰水杨酸处理三角褐指藻后岩藻黄素含量
[0042]
【主权项】
1. 一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 将灭菌海水与MAD母液混合得营养液； 2) 在营养液中加入三角褐指藻母液培养； 3) 培养2天后，加入乙酰水杨酸； 4) 继续培养6天后手机藻液，离心分离，弃上清，收集藻体； 5) 将藻体冷冻干燥处理2天，研磨备用。
2. 根据权利要求1所述的一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法， 其特征在于：所述的 MAD 母液的配方为：KN03:10g，KH2P04:lg，FeS0 4 ? 7H20 :0. 25g，MnS04: 0. 025g，EDTANa2:lg，V B1:0. 0006g，dH 20 :100ml。
3. 根据权利要求1所述的一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其 特征在于：所述的培养条件为：62. 5 y mol photons/ (m2 ? s)，25°C。
4. 根据权利要求1所述的一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其 特征在于： 所述的灭菌海水与MAD母液的体积比为1 : 1000; 所述的营养液与三角褐指藻母液的体积比为1 : 10。
5. 根据权利要求1所述的一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其 特征在于：步骤（3)中培养液加入乙酰水杨酸后乙酰水杨酸的浓度为l〇mg/L?25mg/L。
6. 根据权利要求5所述的一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其 特征在于：步骤（3)中培养液加入乙酰水杨酸后乙酰水杨酸的浓度为l〇mg/L。
7. 根据权利要求1所述的一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其 特征在于：步骤（5)冷冻干燥条件为：温度-70°C，压强999Pa。
【专利摘要】本发明提供了一种用乙酰水杨酸提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，将灭菌海水与MAD母液混合得营养液，在营养液中加入三角褐指藻母液培养，培养2天后，加入乙酰水杨酸，继续培养6天后收集藻液，离心分离，弃上清，收集藻体，将藻体冷冻干燥处理2天，研磨备用。该方法对提高三角褐指藻中的岩藻黄素含量效果显著，操作简单方便，费用低，生产周期短，适于批量处理和工厂化生产。
【IPC分类】C12R1-89, C12N1-38, C12N1-12
【公开号】CN104531603
【申请号】CN201410743645
【发明人】朱帅旗, 龚一富, 刘浩, 马颖瑞, 张静, 陈艺璇, 王何瑜
【申请人】龚一富
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日