一种酶催化生产香料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种香料的生产方法，尤其涉及一种采用酶催化生产香料的方法，属 于生物香料生产技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，人们对风味物质的需求逐渐增加。如2E-或3Z-己烯醛、3-或2-壬烯醛 和3、6_或2、6_壬二烯醛是植物特有香气的主要成分。它们被广泛作为一类食品香气添加 剂来重建水果和蔬菜加工中丢失的"鲜绿"香气。2-壬烯醛是一种木香型食用香料，极低浓 度时表现出很好的香气和香味特征，可以加到天然或合成增香的食品中，例如肉、咖啡及其 它饮料，改善或增强了香气性质，使得食品的香味和香气比天然物还浓，广泛用于调配日化 香精和食用香精，尤其对于增强咖啡香味食品的香气效果极佳。1-辛烯-3-醇具有蘑菇香 味和强烈的壤土香及药草香韵，也是香料行业中一种有价值的合成香料。但这些风味物质 在植物中的含量有限，从天然物中提取的成本较高，加之人们对绿色化学品的要求使得在 食品风味料生产中尽量少采用化学合成法，因而利用生物合成法外源催化合成风味物质成 为一条经济可行、逐渐被重视的路线。如利用大豆脂肪氧合酶结合植物氢过氧化物裂解酶 与面包酵母，形成了一条经济、可行、有效、环境友好的工业化生产路线，生产天然清香味化 合物的工艺。利用该法可得到1-己醇、顺-3-己烯-1-醇等物质。以红花油、亚麻籽油为 原料，利用脂肪氧合酶和氢过氧化物裂解酶联合生产六碳和九碳的醛类物质。
[0003] 由于酶法催化的环保、安全性，现已越来越多被开发使用。但是，目前都是使用双 酶联用或者粗酶提取物方法进行，同时带来了酶反应体系不好控制、产物得率有所降低等 不良现象。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是另提供一种酶催化生产香料的方法，该方法生产的 香料具有天然香味。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种酶催化生产香料的方法，其 特征在于包括如下步骤：
[0006] 1)将浓度为25?250mg / mL的鱼油水解物加入至浓度为25?50mg / L的双活性 脂氧合酶蛋白溶液中，鱼油水解物与双活性脂氧合酶蛋白溶液的体积比为1 :1〇〇?150,于 18?22°C下避光震荡反应1?2h，得到反应液，反应液中水解物的浓度为300?2500mg / L ；
[0007] 2)上述反应液用乙醚萃取，乙醚与反应液的体积比为1 :0. 8?1. 2,萃取获得的有 机相用无水硫酸镁干燥，于20?25°C蒸发浓缩，获得香料。
[0008] 步骤2)中所述乙醚萃取方法为：向反应液中加入乙醚，乙醚与反应液的体积比 为I :0.8?1.2,于4?KTC避光震摇15?30min，离心处理5?15min，转速为6000? lOOOOrpm，收集上层有机相，并对下层相重复抽提至1?2次，合并有机相，加入1?IOOg 无水硫酸镁干燥。
[0009] 所述鱼油为含有多聚不饱和脂肪酸的食用鱼油、饲料鱼油或深海鱼油，所述多聚 不饱和脂肪酸为二十碳四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
[0010] 获得的所述香料为C-8、C-9、C-IO的烯醛和烯醇类物质。
[0011] 所述鱼油水解物按照100?25mg :1ml比例将鱼油加入溶液A中，得到溶液B，溶 液A为浓度为5?7wt %的KOH-甲醇水溶液，溶液A中，甲醇与水的体积比为3. 8?4. 2 : 1，向溶液B中充氮气Imin后55?65°C水浴1?2h，冷却后用18?22wt % HCl调节pH至 小于1，得到溶液C，再用25?35mL体积比为I :3. 8?4. 2的氯仿/正己烷混合液分多次 进行抽提，离心后取上层有机相进行室温旋转蒸发后，加1?4mL甲醇进行溶解，得鱼油水 解物。
[0012] 最后，所述双活性脂氧合酶蛋白溶液为双活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液。
[0013] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本方法利用鱼油作为原料，通过与具有氢过 氧化物裂解酶功能的脂氧合酶的一步催化反应，生产多种具有天然香味的香料，这类香料 物质主要涉及C-8, C-9, C-IO的醛类和醇类物质等。本方法所用原料来源丰富、成本低，且 反应条件温和，生产效率高、快速，无有害物质产生，可同时获得多种具有天然风味的香料。 本方法将为香料工业开辟一条高效、快速生产烯醛类具有天然风味香料的新途径，并为食 品添加剂工业和日化工业提供新的物质基础。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0015] 实施例1 :双活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液的制备
[0016] 采用Takara RNAiso Plus kit (Takara，日本），以trizol法提取坛紫菜叶状体的 总 RNA。采用 Takara primescript RT reagent kit (Takara，日本），对提取的坛紫菜叶状 体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。以此cDNA为模板，用一对带Nde I / Hind III酶切位点的特异性引物扩增PhLOX基因的完整0RF，引物序列如下：
[0017] 正向引物：5' GGAATTCCATATGATGGGGAATGCG3'
[0018] 反向引物：5' CCCAAGCTTCTAGATGTCGATGGACAG3'。
[0019] 克隆的目的片段首先连接到PMD-18T (Takara，日本）上形成L0X-18T的重 组克隆载体，通过转化E. coli DH5ci进行测序，以检测目的片段的编码正确性。选择 pET-28a (Takara，日本）为表达载体，在每40 μ L体系中，取L0X-18T和pET-28a空载体各 I Ug并各自用2U的Nde I / Hind 111收〇1^8，英国）进行双酶切，371：孵育211以上。 取5μ L酶切产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，待质粒酶切完全后进行割胶回收和定 量。在每20 μ L体系中，将回收的目的片段和表达载体按135ng / 50ng的比例进行连接， 采用IU的T4连接酶（Fermentas，美国）在4°C下连接过夜，以构建重组质粒L0X-28a。取 所有连接液，与100μL感受态E.coliBL21(Takara，日本）快速混匀，冰中预冷30min，后 42°C水浴热激90s，热激后立即插在冰中，以构建重组体系L0X-28a-BL21。冰浴5min后加 入800μ L、4°C预冷的LB液体培养基，37°C下200r / min摇菌2h。后取100μ L菌液均匀 涂布在含50yg / mL卡那霉素（Kana+)的LB固体平板上。平板倒扣放置在37°C下避光 培养12h?16h，用10 μ L无菌移液枪头将肉眼可见的乳白色菌落挑取并溶解于20 μ L、含 SOyg / mL卡那霉素的LB液体培养基中。取IyL该菌液作为模板，用上述带Nde I / Hind III酶切位点的特异性引物进行PCR检测，检测程序同表1，PCR体系同表2。取5μ L 该PCR产物通过1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测其对应菌液的真阳性，后将剩余19 μ L菌液转 移至5mL的LB+Kana+(50yg / mL)液体培养基中扩大培养，37°C、200r / min、12h。取ImL 菌液送测序以确定重组载体的编码正确性，得到的真阳性克隆体LOX-28a-BL21。
[0020] 表IPhLOX的PCR检测程序
【主权项】
1. 一种酶催化生产香料的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 将浓度为25?250mg / mL的鱼油水解物加入至浓度为25?50mg / L的双活性 脂氧合酶蛋白溶液中，鱼油水解物与双活性脂氧合酶蛋白溶液的体积比为1 :1〇〇?150,于 18?22°C下避光震荡反应1?2h，得到反应液，反应液中水解物的浓度为300?2500mg / L ； 2) 上述反应液用乙醚萃取，乙醚与反应液的体积比为1 :0. 8?1. 2,萃取获得的有机相 用无水硫酸镁干燥，于20?25°C蒸发浓缩，获得香料。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述鱼油为含有多聚不饱和脂肪酸的食 用鱼油、饲料鱼油或深海鱼油，所述多聚不饱和脂肪酸为二十碳四烯酸、二十碳五烯酸或 二十二碳六烯酸。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述萃取方法为：向反应液中 加入乙醚，乙醚与反应液的体积比为I :0.8?1.2,于4?KTC避光震摇15?30min，离心 处理5?15min，转速为6000?lOOOOrpm，收集上层有机相，并对下层相重复抽提至1?2 次，合并有机相，加入1?IOOg无水硫酸镁干燥。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：获得的所述香料为C-8、C-9、C-10的烯醛 和烯醇类物质。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鱼油水解物按照100?25mg :1ml比 例将鱼油加入溶液A中，得到溶液B，溶液A为浓度为5?7wt %的KOH-甲醇水溶液，溶液A 中，甲醇与水的体积比为3. 8?4. 2 :1，向溶液B中充氮气Imin后55?65°C水浴1?2h，冷 却后用18?22wt % HCl调节pH至小于1，得到溶液C，再用25?35mL体积比为I :3. 8? 4. 2的氯仿/正己烷混合液分多次进行抽提，离心后取上层有机相进行室温旋转蒸发后，力口 1?4mL甲醇进行溶解，得鱼油水解物。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双活性脂氧合酶蛋白溶液为双活性 脂氧合酶蛋白PhLOX溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种酶催化生产香料的方法，该方法以含有二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十碳四烯酸(ARA)等多不饱和脂肪酸为主要成分的鱼油为原料，利用一种具有氢过氧化物裂解功能的脂氧合酶为酶反应工具，一步完成对鱼油水解产物的氧化裂解反应，高效、快速地获得多种具有天然香味的香料化合物。
【IPC分类】C12P7-24, C12P1-00, C12P7-26
【公开号】CN104561102
【申请号】CN201310505549
【发明人】朱竹君, 陈海敏, 严小军, 骆其君, 杨锐, 陈娟娟
【申请人】宁波大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月22日