-FAM
[0041] 本发明第二方面提供了一种检测CYP4F2基因多态性的试剂，所述的试剂包含上 述各项检测探针。
[0042] 本发明第三方面提供了一种检测CYP4F2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述 的试剂盒包含上述各项检测探针。
[0043] 为了增加探针的融解温度（Tm值），本发明的探针是使用了锁核酸，在探针中大写 字母是表示锁核酸碱基。
[0044] 本发明的技术方案的第四方面还提供一种基因扩增用引物对，所述的引物对包括 正向引物和反向引物；
[0045] 正向引物是由序列3的碱基序列组成的寡核苷酸；
[0046] 反向向引物由序列4的碱基序列组成的寡核苷酸。
[0047] 序列 3C3-S-1 :ATCAGTGTTTTCGGAACCCATC
[0048] 序列 4C3-A-1 :GAGGGGCCCCGCACC
[0049] 所述的基因扩增用引物对用于通过基因扩增法扩增CYP4F2基因。
[0050] 本发明第五方面还提供了一种基因扩增用试剂，用于扩增CYP4F2基因，所述的基 因扩增用试剂含有本发明的基因扩增用引物对。
[0051] 本发明第六方面还提供了一种基因扩增用试剂盒，其特征在于，包含能使模板进 行扩增的引物，所述的引物对选自上述任一项所述的基因扩增用引物对。
[0052] 本发明第七方面还提供了一种制备扩增产物的方法，其特征在于，所述的方法包 括如下步骤：
[0053] (I)以样品中的核酸为模板，使用权利要求上述任一项所述的基因扩增用引物对， 在反应液中进行CYP4F2基因的扩增步骤。
[0054] 本发明提供的扩增产物的方法，其特征在于，在所述的步骤⑴中，向所述反应液 中进一步添加与CYP4F2基因的检测对象位点杂交的探针。
[0055] 本发明提供的扩增产物的方法，其特征在于，所述的探针可以是上述任一项的探 针。
[0056] 本发明提供的扩增产物的方法，其特征在于，该方法还进一步包含下述步骤（II)
[0057] (II)测定所述反应液的所述荧光标记探针中的荧光标记的荧光强度的步骤。
[0058] 本发明第八方面还提供了一种试剂，其特征在于，所述的试剂含有上述任一项的 探针以及上述任一项所述的基因扩增用引物对。
[0059] 本发明第九方面还提供了一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有上述任一 项的探针以及上述任一项所述的基因扩增用引物对。
[0060] 优选的本发明的试剂盒，含有如下物质：
[0061] Tris-HCl(pH 7. 5-9. 0)10-100mmol/L
[0062] KCL 6-500mmol/L
[0063] MgCl2 I. 5-5. Ommol/L
[0064] dNTP 0. 2mmol/L
[0065] 选自本发明上述任一项的引物200-900nmol/L
[0066] 选自本发明上述任一项的探针100-900nmol/L
[0067] 耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）2. 0-2. 5U
[0068] 优选的引物的终浓度200-700nM，更优选的引物的终浓度200-500nM，最优选的引 物的终浓度300nM。
[0069] 优选的探针的终浓度200-700nM ;更优选的探针的终浓度300-500nM ;最优选的探 针的终浓度400nM。
[0070] 本发明的试剂盒，优选的还含有基因型外对照和\或内对照。
[0071] 优选的基因型外对照选自突变型基因型对照、野生型基因型对照和杂合型基因型 对照。
[0072] 本发明第十方面提供了一种检测CYP4F2基因多态性的方法，其特征在于，使用本 发明上述的任一项试剂盒来检测CYP4F2基因多态性。
[0073] 本发明所述的CYP4F2基因多态性的检测方法，还包括如下步骤：
[0074] (1)将生物样品进彳丁 DNA提取；
[0075] (2)将提取的DNA加入本发明上述的任一项的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；
[0076] (3)通过荧光信号的变动来确定CYP4F2基因多态性。
[0077] 本发明所述的CYP4F2基因多态性的检测方法，其特征在于，优选的生物样品是全 血。
[0078] 生物样本DNA的提取可以使用本领域常规的技术进行，例如参照RelaxGene血液 基因组DNA提取试剂盒的方法
[0079] I. EDTA抗凝静脉血2mL-4mL，加入5mL裂解液CL裂解血细胞，将溶液转移至干净 无菌的15mL离心管中，颠倒混匀；2, 000X g室温离心5分钟，弃掉上清，保留沉淀；
[0080] 2.加入5ml裂解液CL于离心管中，剧烈震荡直至沉淀完全溶解，2, 000 X g室温离 心5分钟；
[0081] 3.弃上清，加入蛋白酶k消化液2. 5ml，涡旋混匀；56°C水浴10分钟。
[0082] 4.加入2. 5ml异丙醇，轻轻摇动离心管，将丝状基因组DNA挑出。
[0083] 5.于70%乙醇中洗涤DNA，干燥；
[0084] 6.加入400ul缓冲液TB，溶解DNA。
[0085] 本发明第十一方面提供了一种判断华法林的使用量的方法，其特征在于，该方法 包括：
[0086] (1)通过本发明提供的任一项所述的多态性检测方法来检测CYP4F2基因多态性 的步骤；
[0087] (2)通过所检测出的多态性的有无来判断华法林的适用量的步骤。
[0088] 有益技术效果：
[0089] 即使是含有杂质的样品。例如全血或口腔黏膜，可以更加迅速并且简便的进行扩 增反应。另外，如果使用本发明的引物对，可以用比以往更加优良的增幅效率进行扩增反 应，还可以缩短扩增反应。因此根据本发明的引物及含有其的试剂，以及使用它们的扩增产 物的制造方法，可以迅速并且简便的分析CYP4F2基因的多态性。
[0090] 本发明的基因扩增用引物对，优选在扩增全血样品等生物样品中的CYP4F2基因 时使用。
[0091] 通过在基因扩增体系中添加本发明的探针，在PCR反应结束后仅仅通过荧光曲线 的分析就能进行多个基因突变型的分型。
[0092] 进而，由于能够直接检查全血，口腔黏膜悬液，因此能够减少所花费的时间和成 本。
[0093] 本发明的探针特异性强，检测灵敏度高。
[0094] 本发明的方法装置简单，易于实现自动化。
[0095] 使用本发明的方法，在进行PCR的情况下，无需取出扩增产物，因此不存在污染的 危险。
【附图说明】
[0096] 附图为该位点经过荧光定量PCR后的扩增曲线图。图中不同颜色的两条线，分别 代表2种等位基因（G/A)，直线代表没有扩增的等位基因，上升的曲线代表扩增的等位基 因。浅色线检测的是HEX荧光，浅色线扩增代表野生型（GG)，图例CYP4F2-G表示。深色线 检测的是FAM荧光，深色线扩增代表突变型（AA)，图例CYP4F2-A表示。2条上升的曲线代 表2种等位基因均扩增，为杂合型。
[0097] 图1，CYP4F2基因是杂合型的PCR扩增荧光曲线。
[0098] 图2, CYP4F2基因是突变型的PCR扩增荧光曲线。
[0099] 图3, CYP4F2基因是野生型的PCR扩增荧光曲线。
[0100] 图4,样品1的PCR扩增荧光曲线，图4和图3基本相同，受试者甲是野生型。 [0101] 图5,样品2的PCR扩增荧光曲线，图5和图1基本相同，受试者乙是杂合型。
[0102] 图6,样品3的PCR扩增荧光曲线，图6和图2基本相同，受试者丙是突变型。
[0103] 图7,样品4的PCR扩增荧光曲线，图7和图3基本相同，受试者甲是野生型。
[0104] 图8,样品5的PCR扩增荧光曲线，图8和图1基本相同，受试者乙是杂合型。
[0105] 图9,样品6的PCR扩增荧光曲线，图9和图2基本相同，受试者丙是突变型。
【具体实施方式】
[0106] 下面结合本发明的实施例对本发明进行说明，但是本发明不受下述实施例的任何 限制。
[0107] 实施例1
[0108] 一、制备CYP4F2基因用探针和引物对
[0109] 使用常规的技术制备CYP4F2基因用探针和CYP4F2基因用引物对。
[0110] 具体序列如下：
[0111] CYP4F2基因用探针
[0112] CYP4F2 突变型探针 C3-P-M :FAM-aacccagctAtgtggccgg-BHQ2
[0113] CYP4F2 野生型探针 C3-P-W :HEX-aacccagctGtgtggccg-BHQ2
[0114] CYP4F2基因用引物对
[0115] 正向引物序列 C3-S-1 :ATCAGTGTTTTCGGAACCCATC
[0116]