D NO:60)
[0130] GCTCTTCCAGTGAGAATGTCTTTCCGG(SEQ ID NO:61)
[0131] -靶向stxl和stx2的引物组，由以下序列定义：
[0132] TTTGTYACTGTSACAGCffGAAGCYTTACG(SEQ ID NO:62)
[0133] CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACRTC(SEQ ID NO:63)
[0134] 用于检测所述扩增产物的探针的非限制性的例子给出如下：
[0135] -允许衍生自espK的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0136] ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG(SEQ ID NO:64)；
[0137] -允许衍生自espV的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0138] CTTGCAACACGTTACGCTGCCGAGTATT(SEQ ID NO:65)；
[0139] -允许衍生自UreD的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0140] TACGCTGATCACCATGCCTGGTGC(SEQ ID NO:66)；
[0141] -允许衍生自Z2098的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0142] TAACTGCTATACCTCCGCGCCG(SEQ ID NO:67)；
[0143] -允许衍生自Z1153的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0144] TGTAACACCCAGACGGTCAGCAACATG(SEQ ID NO:68)；
[0145] -允许衍生自Z1154的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0146] TCACTTCCAGTTTCTGGTGATGTTTTGAT(SEQ ID NO:69)；
[0147] -允许衍生自Z1155的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0148] TGGGTGAGGTTAAAATATAAAGAACGATTGC(SEQ ID NO:70)；
[0149] -允许衍生自Z1156的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0150] TAAGATATTTTCTGACTTTCCGCATGCGCTT(SEQ ID NO:71)；
[0151] -允许衍生自Z1151的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0152] AAAGAGCCAGCGCAGAGCTGACCAG(SEQ ID NO :72)；
[0153] -允许衍生自Z6065的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0154] TTCGCTGGAAGCAGAGCCCGTGC(SEQ ID NO:73)；
[0155] -允许衍生自stxl的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0156] CTGGATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGTAA(SEQ ID NO :74)；
[0157] -允许衍生自stx2的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
[0158] TCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCC(SEQ ID NO:75)；
[0159] 有利地，本发明提供了一种用于预测样品是否含有EHEC 0157: [H7]、0145: [H28]、 0103: [H2]、0111: [H8]、0121: [H19]、026: [H11]和 045: [H2]血清型的至少之一的典型的肠 出血性大肠杆菌（EHEC)，并且进一步鉴定所述EHEC的血清型的方法，其中所述方法包括：
[0160] -进行用于评估所述样品是否包括如上所述的0157: [H7]、0145: [H28]、 0103: [H2]、0111: [H8]、0121: [H19]、026: [Hll]、045: [H2]和 0104:H4 血清型的至少之一的 EHEC的PCR测定，并且如果所述PCR测定的结果是阳性的，
[0161] -进行如上所述的用于鉴定EHEC的血清型的PCR测定。
[0162] 本发明的PCR测定可以用于测试潜在含有EHEC的物质的任何样品，例如食物样 品、水样品、土壤样品等。
[0163] 本发明的PCR测定可以采用适合靶序列PCR扩增的任何方法，采用任何适用于 该目的的各种天然或工程化的酶进行。还可以采用替代性方法（例如基于核酸序列的扩 增（NASBA)、分支DNA、链置换扩增或环介导的等温扩增（LAMP)方法（Compton 1991，Chang 1991, Walker et al. 1992, Notomi et al.,2000))〇
[0164] 特别优选的方法是包括实时PCR扩增（如Ian EMackay in "Real-time PCR in Microbiology: from diagnosis to characterization"（2007)Caister Academic Press, Norfolk, UK 所述）的那些。
[0165] 实时PCR，也称为定量实时聚合酶链式反应（qPCR)或动力学聚合酶链式反应，用 于扩增并同时定量靶DNA分子。它使DNA样品中特定序列的检测和定量（为绝对拷贝数或 用DNA添加量或额外标准化基因进行标准化时的相对量）同时进行。步骤遵循聚合酶链式 反应的一般原理；其关键特征是所扩增的DNA随着其在反应在的累积在每个扩增循环后以 实时方式定量（Mackay2007)。定量的两钟常用方法是采用插入双链DNA的荧光染料，和当 与互补DNA杂交时发出荧光的经修饰的DNA寡核苷酸探针（Mackay 2007)。在本发明中，本 发明人已经显示了这两种方法的第二种，但基于插入荧光染料的定量PCR产物的另一种方 法也在本发明的范围之内。
[0166] 合适的荧光标记的非限制性例子包括6-羧基-荧光素（FAM)、四氯-6羧基荧光素 (TET)、6_羧基-X-罗丹明（ROX)。用于标记双标记探针的合适的淬灭剂的非限制性例子包 括6-羧基-四甲基-罗丹明（TAMRA)、DABCYL、非荧光淬灭剂如黑洞淬灭剂家族（BHQ)的 淬灭剂或包括小沟结合物基团（MGB)。
[0167] 本发明的每个PCR测定都可以通过对每个靶序列进行单独的PCR反应进行（单 重PCR)。但是，在许多情况下，优选进行多重PCR，从而能够在单个反应中扩增几个靶序列。 有利地，人们可以采用宏阵列（macroarray)，即例如基板的预制结构，所期望的DNA引物 已经点样于其上。这样的宏阵列允许如本文所述的多重PCR测定的常规进行。通过举例 的方式，可以采用例如由Beutin et al. (Beutin et al. 2009)所述的GeneDisc?宏阵列 (Pall-GeneDisc Technology, Bruz, France)，其允许在预装有用于检测和定量所需革E标所 必须的试剂的反应小室中同时对多个靶标进行检测。
[0168] 为了确保该测定的结果代表该样品的真实内容物，其还可以包括阴性扩增对照以 确保任何所检测到的产物是真正阳性的以及还包括抑制对照以确保来自该样品的DNA能 够被扩增并因此没有产生假阴性结果。
[0169] 本发明还涵盖允许进行本发明的PCR测定的上述引物组和探针，以及与这些引物 组和这些探针相关、最终与进行PCR反应的试剂相关的试剂盒。这些试剂盒还可以包括进 行所述扩增反应的说明书。采用本发明的引物所得的扩增产物也是本发明的一部分。
[0170] 根据第一个实施方案，本发明的试剂盒包括引物的组合，所述引物的组合包括：
[0171] -由序列SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所定义的引物组和由序列SEQ ID NO: 13 和SEQ ID NO: 14所定义的引物组，和/或由序列SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所定义的 引物组；
[0172] -由序列SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所定义的引物组；
[0173] -由序列 SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20 和 SEQ ID N0:21 所定义的引物组；
[0174] -由序列SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所定义的引物组；
[0175] -由序列SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25所定义的引物组；
[0176] -由序列SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所定义的引物组；
[0177] -由序列SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所定义的引物组；
[0178] -由序列SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:31所定义的引物组；
[0179] 优选地，所述试剂盒还包括：
[0180] -允许检测衍生自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的扩增产物的探针，和允许检测衍 生自SEQ ID N0:3的扩增产物的探针，和/或允许检测衍生自SEQ ID N0:4的扩增产物的 探针，如上所定义的；
[0181] -允许检测衍生自SEQ ID NO:5的扩增产物的探针，如上所定义的；
[0182] -允许检测衍生自SEQ ID NO:6的扩增产物的探针，如上所定义的；
[0183] -允许检测衍生自SEQ ID NO:7的扩增产物的探针，如上所定义的；
[0184] -允许检测衍生自SEQ ID NO:8的扩增产物的探针，如上所定义的；
[0185] -允许检测衍生自SEQ ID NO:9的扩增产物的探针，如上所定义的；
[0186] -允许检测衍生自SEQ ID NO: 10的扩增产物的两种探针，如上所定义的。
[0187] 根据第二个实施方案，本发明的试剂盒包括：
[0188] -衍生自espK的引物组，和
[0189] - 一个或多个选自以下引物组：衍生自espV的引物组、衍生自ureD的引物组、衍 生自Z2098的引物组、衍生自Z1151的引物组、衍生自Z1153的引物组、衍生自Z1154的引 物组、衍生自Z1155的引物组、衍生自Z1156的引物组、衍生自Z6065的引物组。
[0190] 优选地，所述试剂盒还包括允许检测衍生自espV的扩增产物的探针，和一个或多 个选自以下的探针：允许检测衍生自espV的扩增产物的探针、允许检测衍生自ureD的扩 增产物的探针、或允许检测衍生自Z2098的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z1151的扩增 产物的探针、允许检测衍生自Z1153的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z1154的扩增产物 的探针、允许检测衍生自Zl 155的扩增产物的探针、允许检测衍生自Zl 156的扩增产物的探 针、允许检测衍生自Z6065的扩增产物的探针。
[0191] 根据上述第二个实施方案的试剂盒可以进一步包括靶向stxl的引物组和靶向 stx2的引物组，和优选允许检测衍生自stxl的扩增产物的探针，和允许检测衍生自stx2的 扩增产物的探针。
[0192] 为了更好地理解本发明并且显示同样的内容如何付诸