实施，将仅通过例子的方式 显示本发明的具体实施方案、方法和过程。
【具体实施方式】
[0193] 实施例1 :用于肠出血性大肠杆菌（EHEC)的特异性鉴定的衍生自CRISPRS基因座 的DNA序列的鉴定
[0194] 材料与方法
[0195] 菌迭
[0196] 通过高通量实时PCR研宄其CRISPR基因座的大肠杆菌株（η = 955)列于下表I 中。
[0197] 表I :大肠杆菌株
[0198]
【主权项】
1. 一种用于鉴定怀疑存在于样品中的肠出血性大肠杆菌（EHEC)的血清型的方法，其 中所述方法包括检测在所述样品或由其分离的DNA中以下大肠杆菌CRISPR序列的存在或 不存在： a) 用于鉴定EHEC 0157: [H7]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列选自以下的序列： -CRISPR 序列 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:3,其中所述 CRISPR SEQ ID NO: 1-3的一个或多个序列的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在；和/或 -CRISPR序列SEQ ID N0:4,其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0157: [H7]的存 在； b) 用于鉴定EHEC 0145:[H28]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 5,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0145: [H28]的存在；和 c) 用于鉴定EHEC 0111:[H8]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 6,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0111: [H8]的存在；和 d) 用于鉴定EHEC 0121:[H19]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 7,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0121: [H19]的存在；和 e) 用于鉴定 EHEC 0103: [H2]和 / 或EHEC 045: [H2]的 CRISPR序列，其中所述 CRISPR 序列是序列SEQ ID NO: 8,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0103: [H2]和/或 EHEC 045: [H2]的存在；和 f) 用于鉴定EHEC 0104:[H4]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID N0:9,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0104: [H4]的存在；和 g) 用于鉴定EHEC 026:[H11]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 10,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 026: [H11]的存在。
2. 权利要求1的方法，其中所述方法包括对所述样品或由其分离的DNA用靶向所述 CRISPR序列的引物的组合进行PCR测定。
3. 权利要求2的方法，其中所述引物的组合包括： a) 用于检测EHEC 0157: [H7]的引物，其中所述引物由以下组成： -靶向两个CRISPR序列SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2的引物组，其中所述引物由以下 序列定义： GGGAACACAAACCGAAACACA(SEQ ID NO:11) CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID N0:12)和 -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:3的引物组，其中所述引物由以下序列定义： GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(SEQ ID NO:13)； CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID NO:14), 其中针对所述引物组至少之一的扩增产物的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在；和/ 或. -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:4的引物组，其中所述引物由以下序列定义： GAACACAAACCGAAACACACG(SEQ ID NO:15) ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(SEQ ID NO:16), 其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在；和 b) 用于检测EHEC 0145: [H28]的引物，其中所述引物由以下组成： -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:5的引物组，其中所述引物由以下序列定义： GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(SEQ ID NO:17) ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(SEQ ID NO:18), 其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC 0145: [H28]的存在；和 c) 用于检测EHEC 0111:[H8]的引物，其中所述引物由以下组成： -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:6的引物组，其中所述引物由以下序列定义： GTGACCGCCTGTACACGC(SEQ ID NO:19) CGGATATTTGGGCGTAATACC(SEQ ID NO:20) CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(SEQ ID NO:21), 其中针对引物对 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 21 的 至少之一的扩增产物的存在表示EHEC 0111: [H8]的存在；和 d) 用于检测EHEC 0121: [H19]的引物，其中所述引物由以下组成： -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:7的引物组，其中所述引物由以下序列定义： CGGGGAACACTACAGGAAAGAA(SEQ ID NO:22) GGCGGAATACAGGACGGGTGG(SEQ ID NO:23), 其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC 0121: [H19]的存在；和 e) 用于检测EHEC 0103: [H2]和/或EHEC 045: [H2]的引物，其中所述引物由以下组 成： -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:8的引物组，其中所述引物由以下序列定义： GAGTCTATCAGCGACACTACC(SEQ ID NO:24) AACCGCAGCTCGCAGCGC(SEQ ID NO:25), 其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC 0103: [H2]和/或EHEC 045: [H2] 的存在；和 f) 用于检测EHEC 0104: [H4]的引物，其中所述引物由以下组成： -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:9的引物组，其中所述引物由以下序列定义： GGAACTCACCGAGCGCCG(SEQ ID NO:26)； GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC(SEQ ID NO:27)； 其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC 0104: [H4]的存在；和 g) 用于检测EHEC 026: [H11]的引物，其中所述引物由以下组成： -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:10的两个引物组，其中第一引物组由以下序列定义： ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG(SEQ ID NO:28) GATAAACCGTGGTACGGAACA(SEQ ID勵:29)，第二引物组由以下序列定义： TGAAACCACTCGCGGCAGAT(SEQ ID NO:30)； ATAAACCGATCTCCTCATCCTC(SEQ ID NO:31)； 其中针对所述引物组的至少之一的扩增产物的存在表示EHEC026: [Hll]的存在。
4. 一种用于预测样品是否含有 EHEC 0157: [H7]、0145: [H28]、0103: [H2]、0111: [H8]、 0121: [H19]、026: [Hll]、045: [H2]和 0104: [H4]血清型的至少之一的 EHEC 的方法，其中 所述方法包括espK基因和以下靶基因的一个或多个的检测：espV、ureD、Z2098、Z1151、 Z1153、Z1154、Z1155、Z1156 和 Z6065。 5?权利要求4的方法，其中所述方法包括espK基因、选自espV、ureD、Z2098、Z1151、 Z1153、Z1154、Z1155、Z1156中至少一个基因和Z6065基因的检测。
6. 权利要求4或5任一项的方法，其中所述方法包括对所述样品或由其分离的DNA用 包括衍生自 espK 的引物组和衍生自 espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156 和Z6065至少之一的引物组的引物的组合进行PCR测定和检测针对所述组合的每个引物组 的扩增产物的存在或不存在。
7. 权利要求4-6任一项的方法，其进一步包括对所述样品或由其分离的DNA用包括衍 生自stxl的引物组和衍生自stx2的引物组的引物的组合进行PCR测定和检测针对所述组 合的每个引物组的扩增产物的存在或不存在。
8. 权利要求1-3任一项的方法，其包括用于预测所述样品是否含有EHEC0157: [H7]、 0145: [H28]、0103: [H2]、0111: [H8]、0121: [H19]、026: [H11]、045: [H2]和 0104: [H4]血清 型的至少一个的肠出血性大肠杆菌（EHEC)的在前步骤，其中所述在前步骤是通过权利要 求4-6任一项的方法进行的。
9. 一种用于肠出血性大肠杆菌（EHEC)的血清型的鉴定的试剂盒，包括权利要求3中所 定义的引物组，和任选的用于检测针对所述引物组的每个的扩增产物的探针。
10. 权利要求9的试剂盒，进一步包括衍生自espK的引物组和至少一个选自以下的 引物组：衍生自Z2098的引物组、衍生自Z1151的引物组、衍生自Z1153的引物组、衍生自 Z1154的引物组、衍生自Z1155的引物组、衍生自Z1156的引物组、衍生自Z6065的引物组， 和任选的用于检测针对所述引物组的每个的扩增产物的探针。
11. 权利要求9或10任一项的试剂盒，进一步包括革E1向stxl和stx2的引物组，和任选 的用于检测来自stxl的扩增产物的探针和用于检测来自stx2的扩增产物的探针。
【专利摘要】本发明涉及通过基因espK结合Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、Z2098、ureD或espV的至少一个遗传标记的检测和/或通过血清型特异的CRISPR序列的检测，用于预测样品是否含有EHECO157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]或O104:[H4]血清型的至少一个的肠出血性大肠杆菌(EHEC)的方法，以及用于鉴定所述血清型的方法。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104619860
【申请号】CN201380030965
【发明人】P·法赫, S·德兰诺伊, L·伯坦
【申请人】国家食品安全环境及劳工局
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年6月14日
【公告号】CA2875919A1, EP2674501A1, EP2861762A2, US20150176064, WO2013186754A2, WO2013186754A3