体实施例，进一步阐述本发明。
[0032] 1.本发明所需主要试剂的制备
[0033] (1)探针合成
[0034] 委托商业探针合成公司合成探针：
[0035]探针：[FITC]-5'-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列SEQIDNO :1)
[0036] FITC:异硫氰酸焚光素（fluoresceinisothiocyanate)，通过一个氨基连接分子 与探针5'端相连，
[0037] 以无菌蒸馏水溶解，配制成浓度10ng/y1。
[0038] (2)配制杂交缓冲液：
[0039] 杂交缓冲液包含：20mMTris-HCl，20% 甲酰胺，900mMNaCl。
[0040] (3)配制洗脱缓冲液：
[0041] 洗脱缓冲液包含：20mMTris-HCl，0. 01%SDS，225mMNaCl和 5mMEDTA。
[0042] (4)制备阳性试剂盒性、阴性对照品：分别使用长滩军团菌（ATCC33462)和嗜肺军 团菌（ATCC35072)标准菌株，然后稀释至0. 5麦氏浊度，按0. 5mL分装。
[0043] 将上述制备好的探针、杂交缓冲液、洗脱缓冲液、阴性对照、阳性对照置于同一包 装盒中，组成试剂盒，封装。
[0044] 2.试剂盒的应用（以环境水样本检测为例）
[0045] (1)样品处理
[0046] 将200mL水样注入滤器，开启真空泵，水样通过负压抽滤至干，直接刮取滤膜上沉 淀于5mL无菌蒸馏水中，取lmL转移至1. 5mlEP管内，12000rpm离心1分钟，弃上清，向沉 淀中加入lmL4%多聚甲醛制成菌悬液，置于4°C过夜固定。12000rpm离心3分钟，弃上清， 以PBS缓冲液（PH= 7. 6)重悬菌液。取20y1菌液均匀涂于载玻片上，室温风干。
[0047] (2)荧光原位杂交
[0048] 将涂有菌液的玻片依次置于50%，80%和96 %的乙醇溶液中脱水3分钟，自然风 干。在避光条件下，取含5ng探针的0. 5y1探针溶液以及19. 5y1杂交缓冲液共计20y1 混合，滴加至玻片中央，置于46°C湿盒中杂交2h，之后于46°C预热的洗脱缓冲液洗去未杂 交的探针，去离子水冲洗玻片，避光风干。
[0049](3)荧光显微镜下观察
[0050] 调整激发光波长至490~495nm，在荧光显微镜下观察玻片。（阳性检测结果见图 1，阴性检测结果见图2)
[0051]3.试剂盒的应用（以菌株为例）
[0052](1)样品处理：
[0053] 用接种环挑取待检菌落于1. 5mlEP管内制成4%多聚甲醛菌悬液，置于4°C过夜 固定。12000rpm离心3分钟，弃上清，以PBS缓冲液（PH= 7. 6)重悬菌液。取20y1菌液 均匀涂于载玻片上，室温风干。
[0054] (2)荧光原位杂交：
[0055] 将涂有菌液的玻片依次置于50%，80%和96 %的乙醇溶液中脱水3分钟，自然风 干。在避光条件下，取含5ng探针的0. 5y1探针溶液以及19. 5y1杂交缓冲液共计20y1 混合，滴加至玻片中央，置于46°C湿盒中杂交2h，之后于46°C预热的洗脱缓冲液洗去未杂 交的探针，去离子水冲洗玻片，避光风干。
[0056] (3)焚光显微镜下观察：
[0057] 调整激发光波长至490~495nm，在焚光显微镜下观察玻片。
[0058] 4试剂盒特异性和灵敏度试验
[0059] 特异性
[0060] 按照3.试剂盒的应用（以菌株为例）中的方法，使用本发明的方法检测了 19株 长滩军团菌、4株非军团菌属菌株以及与探针匹配程度较高的21株非长滩军团菌（包括10 株嗜肺军团菌，1株圣克鲁伊军团菌，1株圣海伦军团菌，1株辛辛那提军团菌，4株博兹曼军 团菌，2株麦氏军团菌，2株杜氏军团菌），进行探针的特异性检测试验。结果显示，本发明的 试剂盒能在多种类似菌中特异性的检测出长滩军团菌（附图1和2分别显示了本发明的试 剂盒检测一株长滩军团菌和一株嗜肺军团菌时的显微镜图像，其他阳性/阴性菌株的检测 结果类似）。
[0061] 灵敏度
[0062] 将长滩军团菌标准菌株（ATCC33462)配制0.5麦氏浊度的菌悬液，按10倍体积 作梯度稀释至1〇_7倍，制成人工模拟水样。使用本发明的试剂盒检测，取最低检测浓度菌 悬液20yl涂布至BCYEa平板，36°C，5%C02，培养72h后计数平板上菌落。结果显示在 1.49X103cfU/ml的军团菌浓度下，本发明的试剂盒仍然能检测出样本中的长滩军团菌。
【主权项】
1. 一种检测长滩军团菌的荧光原位杂交试剂盒，其包括根据长滩军团菌特异性序列区 域的荧光标记探针。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述荧光标记探针是根据长滩军团菌16S rRNA中的特异 性区域设计，为[FITC]-5' -CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列为SEQ ID NO :1)。
3. 权利要求1或2所述的试剂盒，还包括荧光原位杂交缓冲液、荧光原位杂交洗脱液、 阳性对照和阴性对照。
4. 权利要求3所述的试剂盒，其成分为： (1) 探针：[FITC]-5,-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列为SEQIDNO:1)的探针，以无 菌蒸馏水溶解，配制成浓度l〇ng/y1 ; (2) 荧光原位杂交缓冲液：20mMTris-HCl，20%甲酰胺，900mMNaCl; (3) 荧光原位杂交洗脱液：20mM Tris-HCl，0. 01% SDS，225mM NaCl和5mM EDTA ; (4) 阳性对照：长滩军团菌标准菌株（ATCC33462)，0. 5mllX104个菌/ml培养物； (5) 阴性对照：嗜肺军团菌标准菌株（ATCC35072)，0. 5mllX104个菌/ml的嗜肺军团菌 培养物。
【专利摘要】本发明提供了一种检测长滩军团菌的荧光原位杂交试剂盒，其包括探针[FITC]-5’-CGTCCTCAGACATCATCC(SEQ ID NO：1)。
【IPC分类】C12Q1-04, C12R1-01, C12Q1-68
【公开号】CN104711342
【申请号】CN201410202061
【发明人】朱庆义, 顾全, 胡朝晖, 严慧
【申请人】广州金域医学检验中心有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2014年5月13日