利用固定化酶微反应器连续制备低聚果糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种利用微反应器酶解菊粉连续制备低聚果 糖的方法。
【背景技术】
[0002] 低聚果糖（Fructo oligosaccharide，FOS)是一种天然活性物质，低聚果糖又称鹿 果低聚糖，是由2~9个果糖基通过0 (2-1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果多 糖混合物，甜度为蔗糖的0. 3-0. 6倍。其保持了蔗糖的纯正甜味，又比蔗糖清爽；是具有调 节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型 甜味剂。低聚果糖被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂一一促生物质；在法国 被称为原生素（PPE)，已在乳制品、乳酸菌饮料、固体饮料、糖果、饼干、面包、果冻、冷饮等多 种食品中应用。
[0003] 工业化生产低聚果糖的方法有两种。一是蔗糖经果糖转移酶催化制备，产物低聚 果糖为CFn型；二是利用菊粉酶定向水解菊糖制备，产物低聚果糖为CFn与Fn的混合型。 在果糖转移酶催化蔗糖制备低聚果糖中，反应副产物葡萄糖是酶的抑制剂，转化率低，产物 中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖仅占55~60%以下，且工艺复杂成本高。菊粉内切酶 定向水解菊粉制备低聚果糖是一步单酶反应，工艺简单，产物中低聚果糖含量高达80%以 上。因此，以菊粉为原料酶法一步水解其中的菊糖制取低聚果糖，具有工艺简单、转化率高、 副产物少的特点。
[0004] 有研宄表明，蔗果四糖具有很强的抗自由基活性，对心血管疾病的预防和治疗效 果明显；相关文章于 2014年在 International Journal of Food Science and Technology 2014,49, 1500 - 1505 上发表，标题是"In vitro anti-hydroxyl radical activity of the fruetooligosaccharides 1-kestose and nystose using spectroscopic and computational approaches''。
[0005] 菊粉内切酶，主要来源于菊科植物组织，前者的底物专一性较强，仅用于菊粉。菊 粉内切酶是一种菊粉水解酶，其作用特性为：从菊糖分子内部随机切断糖苷键，其产物为 GFjP Fn等低聚果糖，n = 2~9。
[0006] 微反应器是一种建立在连续流动基础上的微管道式反应器，其工艺流体的通道在 微米级别，用以替代传统反应器。由于其有较大的比表面积，传质传热效率高，停留时间分 布窄，反应条件可精确控制，安全性高，易于放大，可连续生产等优势近年来备受关注。微反 应器中常用的类型为微通道反应器，可通过PDMS、PMMA、玻璃圆管等来制造。而通道的尺寸 和形状可以通过CFD来进行模拟。
[0007] 固定化酶有很多优点，尤其是稳定性和可重复使用性在很多领域得到了广泛应 用。戊二醛等固定化方法有时会对酶活有严重的损失，比如阻塞活性中心，诱导构象改变 等。随着固定化技术的不断深入，固定用的载体也随之推陈出新，不再局限于用传统的无机 材料或者多糖类材料为载体，而趋于选择提高固定化酶性能的新型功能性材料为载体，比 如介孔材料，纳米材料，磁性微球等等。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用固定化酶微反应器连续制备低聚果 糖的方法，以解决现有技术中存在的合成低聚果糖反应强度低，不能连续化生产等问题，同 时实现低聚果糖的有序可控的生产模式。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0010] 一种利用固定化酶微反应器连续制备低聚果糖的方法，将菊粉内切酶固定在微 反应器中，将底物菊粉水溶液注入到微反应器中，底物流速为0. 1-lmL/min，反应温度为 55-65°C，反应料液在微反应器中循环连续流动的保留时间为2~6h，使菊粉溶液降解为低 聚果糖。
[0011] 其中，所述的底物菊粉水溶液，溶液pH值为3. 5-5. 5 (优选pH4. 6)，溶质菊粉的浓 度为 5_30wt%。
[0012] 其中，所述的微反应器，由盖板和反应板组成，反应板中心的凹槽中含有可拆换 的微通道芯片，微通道芯片上紧密蜿蜒刻有通道，通道的上表面敞开，通道的下表面和侧 面封闭，通道总长为50-200mm，通道的切面呈上宽下窄的类梯形结构，类梯形的长边为 0. 5-1. 5mm，类梯形的短边为0. 1~0. 4mm，类梯形的高为0. 3-1. 0mm，类梯形的四个角按照 圆角化处理，圆角化直径为0. 1mm ;所述反应器的盖板与反应板之间设有固定夹以防止溶 液侧漏，其中，盖板的材质为玻璃或不锈钢，反应板材质为不锈钢。
[0013] 其中，所述的微反应器预先经过如下处理：将聚二甲基硅氧烷溶胶涂抹在盖板内 侧，再用筛板将SH-Ti0 2粉末均匀分布在聚二甲基硅氧烷溶胶上，放入60-80°C烘箱中烘烤 100-200min，使溶胶凝固。
[0014] 其中，所述的SH-Ti02按照如下方法等比例放大或缩小制备得到：将lgTi02分散 于30-50ml的甲苯中，加入5~10ml 3-巯丙基三甲氧基硅烷，在110°C油浴回流6-10h，将 样品抽滤，甲苯洗涤；将滤出样品置于索氏抽提器中，用乙醇于回流温度下抽提12-24h，以 除去未反应的偶联剂；抽滤后取出样品在60°C下干燥24-48h后即可得到SH-Ti0 2。优选的 是，将lgTi02分散于50ml的甲苯中，加入5ml 3-巯丙基三甲氧基硅烷，在110°C油浴回流 8h，将样品抽滤，甲苯洗涤；将滤出样品置于索氏抽提器中，用乙醇于回流温度下抽提24h， 以除去未反应的偶联剂；抽滤后取出样品在60°C下干燥24h后即可得到SH-Ti0 2。
[0015] 其中，所述的筛板孔径800目。
[0016] 其中，将菊粉内切酶固定在微反应器内的方法如下：将菊粉内切酶液注入可拆换 的微通道芯片（3)中，流速控制在1-100 yL/min，保留时间为1-5小时，用超纯水冲洗多余 的酶液，实现酶的固定化。
[0017] 其中，所述的菊粉内切酶，比酶活200-300U/mg，微反应器的固载量为50-200mg。 酶活分析方法如下：1 mL酶液加入4mL3%的菊粉液（用0. lmol/L，pH4. 5醋酸缓冲液配 制），50 °C下反应30min，沸水浴煮沸5min，后取0. 5ml反应液，加入1. 5mL水和1. 5mL3, 5 一二硝基水杨酸试剂，沸水浴加热5min，立即冷却定容至25ml，540nm下测定吸光度，对照 果糖标准曲线计算反应生成的还原糖量；在相同条件下，以每分钟转化生成1 ymol还原糖 所需的酶量为一个酶活力单位。
[0018] 其中，微反应器中菊粉内切酶的酶活为4. 2KU，固载量为20mg，将底物菊粉水溶液 注入到微反应器中，底物流速为0. 1-lmL/min，反应温度为55-65°C，底物pH在3. 5-5. 5,反 应料液在微反应器中循环连续流动的保留时间为2h，再调整反应流速在0. lmL/min，调整 反应温度为65°C、调整底物pH为3. 5,反应料液在微反应器中循环连续流动的保留时间为 4h，制备得到的低聚果糖中，蔗果四糖的浓度在60wt %以上。
[0019] 有益效果：本发明选择利用微反应器酶解菊粉生成低聚果糖，反应效率大大提高， 耗能减少；同时，通过变操作条件控制，可显著提高产物中蔗果四糖的含量，强化低聚果糖 在预防和治疗心血管疾病上的作用。本发明的装置可以拆换微反芯片，结构简单，并且只需 简单的将数目放大即可等比例的扩大生产能力，具有良好的工业化前景。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明微反应器的结构示意图。
[0021] 图2可拆换反应芯片放大图。
[0022] 图3为图2画圈处通道切面结构示意图。
【具体实施方式】
[0023] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0024] 实施例1 :
[0025] 由图1所示，本发明的微反应器，由盖板1和反应板2组成，反应板中心的凹槽中 含有可拆换的微通道芯片3,由图2可知微通道芯片3上紧密蜿蜒刻有通道，通道的上表面 敞开，通道的下表面和侧面封闭，通道总长为50-200mm，通道的切面呈上宽下窄的类梯形结 构（图3)，类梯形的长边为0? 5-1. 5mm，短边为0? 1~0? 4mm，高为0? 3-1. 0mm，类梯形的四 个角按照圆角化处理，圆角化直径为〇. 1_ ;所述反应器的盖板1与反应板2之间设有固定 夹以防止溶液侧漏，其中，盖板的材质为玻璃或不锈钢，反应板材质为不锈钢。
[0026] 实施例2 :