用于非洗提样品的一步法核酸扩增的方法_2

文档序号:8448759阅读:来源:国知局
K0272)。所述 核酸扩增试剂溶液可以干燥形式(例如"Ready-to-Go?"(RTG)规格)存在。聚合酶链反 应试剂的干燥或冻干配方的优点是:它们可通过加入水容易地溶解,由此节约操作员时间 和方便操作员使用。为使操作员误差最小化,可将所述干燥试剂混合物预分配入反应容器 (例如多孔板的孔)中。这类RTG混合物的实例包括从GEHealthcare可得的"Illustra Ready-to-GoRT-PCR珠"(产品代码:27-9266-01IllustraReady-To-GoRT-PCR珠)。
[0027] 在进一步的方面中,STR分布图试剂选自PowerPlex18D、PowerPlex21、 PowerPlexFusion、IdentifierDirect、GlobalfilerExpress和Y-FilerDirect。
[0028] 在进一步的方面中,所述核酸选自DNA、RNA和寡核苷酸。在本文中术语"核酸"与 术语"核苷酸"同义使用并包括DNA(例如质粒DNA和基因组DNA)、RNA(例如mRNA、tRNA、 sRNA和RNAi)和蛋白核酸(PNA)。
[0029] 在一个方面中,离液盐是胍盐。
[0030] 在另一方面中,所述胍盐选自硫氰酸胍、氯化胍和盐酸胍。
[0031] 在一个方面中,离液盐是钠盐(例如碘化钠)。
[0032] 在另一方面中,在步骤i)之后用水性溶液洗涤固体支持物。
[0033] 在一个方面中,固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相介质、基于塑料 的固相介质、基于纤维素的固相介质、玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化硅(silica oxide)、硝酸纤维素、羧甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯 (polytetraflurorethylene)、聚偏二氟乙稀(polyvinylidinefluoride)、羊毛和多孔陶 bti〇
[0034] 在另一方面中,固体支持物是基于纤维素的基质。
[0035] 在进一步的方面中,所述基于纤维素的基质呈预冲压圆片(prepuncheddisc)的 形式。
[0036] 在另一方面中,所述基于纤维素的基质呈FTA?洗提卡(Elutecard)的形式。
[0037] 在另一方面中,所述基于纤维素的基质呈指示FTA?Elute(iFTAe)卡的形式,其 中染料指示生物样品的存在。
[0038] 在一个方面中,其中使用PCR成像系统定量扩增的核酸。
[0039] 在一个方面中,所述细胞样品选自真核的或原核的细胞、病毒、细菌、植物和组织 培养细胞。
[0040] 在另一方面中,所述细胞样品选自血液、血清、精液、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液、 口腔的、颈部的细胞、阴道的细胞、尿、粪便、毛发、皮肤和肌肉。细胞样品可源自哺乳动物、 鸟、鱼或植物或其细胞培养物。优选细胞样品来源上是哺乳动物的、最优选在来源上是人。 该含核酸的样品可源自任何来源。这包括,例如,人和动物的生理学/病理学的体液(例如 分泌物、排泄物、渗出物)或细胞悬浮液;植物的生理学/病理学的液体或细胞悬浮液;细 菌、真菌、质粒、病毒、朊病毒等的液体制品、提取物或悬浮液;人或动物体组织(例如,骨、 肝、肾等)的液体提取物或匀浆;来自DNA或RNA合成的介质、化学上或生物上合成的DNA 或RNA的混合物;和任何其它来源,其中DNA或RNA是或可以是在液体介质中。
[0041] 在另外的方面中,将所述方法用作选自分子诊断学工具、人鉴别工具、法医学工 具、STR概况分析工具和DNA概况分析的工具。
[0042] 在另一方面中,其中在步骤ii)之前将所述核酸储存于固体支持物上。
[0043] 在一个方面中,让核酸在固体支持物上存储至少30分钟。可将核酸固定在固体支 持物上较长时间,例如,至少24小时、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少一 年和至少 10年。按此方式可将核酸以干燥形式(其适合于后续分析)储存。通常,样品被 存储于-200°C-40°C的温度下。此外,可任选将储存的样品储存于干燥的或烘干的条件下 或在惰性气氛下。
[0044] 本发明的方法可在单管或高通量96-孔规格中与由Baron等人(2011,Forensics ScienceInternational:GeneticsSupplementSeries(法医学科学国际:遗传学补充系 列),93,e560-e561)描述的自动化样品加工组合使用。此方法会涉及最小数量的步骤并 且增加了样品通量。操作员引起的误差(例如交叉污染)的风险也被降低了,因为此方法 同与目前使用的更劳力密集型试剂盒(例如QIAmpDNA血液微型试剂盒,Qiagen)相关的 方案相比需要较少操作。样品混乱的风险也被降低了,因为本方法需要较少操作。重要的 是,该方法可容易地转移至多孔规格用于高通量筛选。本发明可由此改良样品加工用于实 施PCR反应以帮助遗传探询(geneticinterrogation)。本发明可在96孔/高通量规格中 实施以方便样品处理并由此消除样品的批处理。
[0045] 在进一步的方面中,反应容器是在多孔板中的孔。多孔板以多种规格可得,所述规 格包括 6、12、24、96、384 孔(例如Corning384 孔多孔板,SigmaAldrich)。
[0046] 在一个方面中,将样品通过从固体支持物冲压出或切割出圆片而转移至反应 容器。从固体支持物冲压出部分或圆片可通过使用冲压机,例如HarrisMicro冲压机 (WhatmanInc. ;SigmaAldrich)而实现。
[0047] 根据本发明的第二方面提供了用于扩增核酸的方法,其包括以下步骤: i) 将包含裂解试剂的固体支持物与含核酸的细胞样品接触, ii) 将所述固体支持物转移至反应容器, iii) 将在固体支持物上的所述核酸与核酸扩增试剂溶液一起孵育, iv) 扩增所述核酸以产生扩增的核酸, v) 定量扩增的核酸, 其中步骤i)_v)在固体支持物的存在下实施。
[0048] 在一个方面中,其中在加入所述细胞样品之前固体支持物已经在反应容器中。 [0049] 在另一方面中,其中扩增方法是聚合酶链反应。
[0050] 在另一方面中,所述裂解试剂选自表面活性剂、去垢剂和离液盐。
[0051] 在另一方面中,裂解试剂选自十二烷基硫酸钠、硫氰酸胍、氯化胍、盐酸胍和碘化 钠。
[0052] 在进一步的方面中,将所述固体支持物用十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸 (EDTA)和尿酸浸渍。
[0053] 在一个方面中,所述固体支持物呈FTA?预冲压圆片的形式。
[0054] 在另一方面中,所述基于纤维素的基质呈指示FTA? (iFTA)卡的形式,其中染料 指示生物样品的存在。
[0055] 在另一方面中,固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相介质、基于塑料的固 相介质或基于纤维素的固相介质、玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化硅、硝酸纤维素、羧 甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙稀、聚四氟乙稀、聚偏二氟乙稀、羊毛或 多孔瓷器。
[0056] 在另一方面中,在步骤i)之后用水性溶液洗涤固体支持物。
[0057] 在一个方面中,其中使用PCR成像系统定量扩增的核酸。
[0058] 在一个方面中,其中细胞样品选自真核的或原核的细胞、病毒、细菌、植物和组织 培养细胞。
[0059]在另一方面中,所述细胞样品选自血液、血清、精液、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液、 口腔的、颈部的和阴道的细胞、尿、粪便、毛发、皮肤和肌肉。细胞样品可源自哺乳动物、鸟、 鱼或植物或其细胞培养物。优选细胞样品来源上是哺乳动物的,最优选在来源上是人。含 核酸的样品可源自任何来源。这包括,例如,人和动物的生理学/病理学的体液(例如分泌 物、排泄物、渗出物)或细胞悬浮液;植物的生理学/病理学的液体或细胞悬浮液;细菌、真 菌、质粒、病毒、朊病毒等的液体制品、提取物或悬浮液;人或动物体组织(例如,骨、肝、肾 等)的液体提取物或匀浆;来自DNA或RNA合成的介质、化学上或生物上合成的DNA或RNA 的混合物;和任何其它来源,其中DNA或RNA是或可以是在液体介质中。
[0060] 在进一步的方面中,将该方法用作选自分子诊断学工具、人鉴别工具、法医学工 具、STR概况分析工具和DNA概况分析的工具。
[0061] 在另一方面中,其中在步骤ii)之前将核酸储存在固体支持物上。
[0062] 在一个方面中,让核酸在固体支持物上储存至少30分钟。可将核酸固定在固体支 持物上较长时间,例如,至少24小时、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少一 年和至少 10年。按此方式可将该核酸以干燥形式(其适合于后续分析)储存。通常,将样 品储存于_200°C-40°C的温度下。此外,可任选将储存的样品储存于干燥的或烘干的条件 下或在惰性气氛下。
[0063] 本发明的方法可在单管或高通量96-孔规格中与由Baron等人,(2011, ForensicsScienceInternational:GeneticsSupplementSeries(法医学科学国际:遗 传补充系列),93,e560-e561)描述的自
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