动化样品加工组合使用。此方法会涉及最少数量 的步骤并增加样品通量。操作员引起的误差（例如交叉污染）的风险也被降低，因为此方 法同与目前使用的更劳力密集型试剂盒（例如QIAmpDNA血液微型试剂盒，Qiagen)相关 的方案相比需要较少操作。样品混乱的风险也被降低，因为该方法需要较少操作。重要的 是，该方法可容易地转移至多孔规格用于高通量筛选。本发明由此可改良样品加工用于实 施PCR反应以帮助遗传探询。本发明可在96孔/高通量规格中实施以方便样品处理和由 此消除样品的批处理。
[0064] 在进一步的方面中，反应容器是多孔板中的孔。多孔板以多种规格可得，所述规格 包括 6、12、24、96、384 孔（例如Corning384 孔多孔板，SigmaAldrich)。
[0065] 在一个方面中，将所述样品通过从固体支持物冲压出或切割出圆片而转移至反 应容器。从固体支持物冲压出部分或圆片可通过使用冲压机，例如HarrisMicro冲压机(WhatmanInc. ;SigmaAldrich)实现。
[0066] 根据本发明的第三个方面，提供用于按本文之前的描述扩增核酸的试剂盒和其使 用说明书。
[0067] 附图简述 图1展现了未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的PCR扩增的STR分布图（重复第1号）。
[0068] 图2展现了未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的PCR扩增的STR分布图（重复第 2号）。
[0069] 图3展现了未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的PCR扩增的STR分布图（重复第 3号）。
[0070] 图4展现了对照DNA样品的PCR扩增的STR分布图。
[0071] 图5展示了直接扩增的洗涤的血液点样的iFTAe的qPCR扩增的DNA收率。
[0072] 图6展示了直接或在洗提后扩增的未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的qPCR扩增 的DNA收率。
[0073] 发明详述 伸用的化学品和材料 下面给出了化学品及其来源的列表： 指示FTA?洗提微卡（elutemicro) (WB120218 和WB120411); 指不FTA?洗提盒（elutecassette) (WB120230); 正常人血液（TissueSolutionsLtd); 基因组DNA(Promega产品代码G152A); Harris 单芯冲压片（Uni-core punch)，l.2mm (Sigma，目录号 Z7〇886〇_25ea,批号 3110)； TaqManUniversalPCRmasterMix,无AmpEraseUNG(AppliedBiosystems部分号 4324018)； TaqManRNaseP检测试剂（AppliedBiosystems部分号 4316831)-含有RNaseP引物； PowerPlex lSD (Promega 代码 DCl8〇2)-含引物； 无菌水（Sigma产品代码W4502); Huma宫颈上皮细胞（HeLa) (ATCC代码CCL-2)和Hi-Di甲酰胺（ABI代码 4311320) 实验结果 Hela细朐点样的FTA洗提卡的STR分布图 将处于2. 5X106个细胞/ml浓度的培养的HeLa细胞点样至指示FTA洗提（iFTAe)卡 上。将1. 2mm冲压片从细胞点样FTA洗提卡上取出并与直接STR试剂盒PowerPlex18D反 应混合物组合达到最终体积25W。在扩增之前将所述25W样品混合物加入96孔PCR板的 各孔。使用10秒样品注射在3130x1毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis)上分析样 品。
[0074] PCR反应按如下建立： 将标准品和样品加入合适的孔。将板密封并在l〇〇〇rpm下离心1分钟。PCR在Geneamp/ ABI 9700 Thermo Cycler上在以下热循环条件下实施： 96°C2分钟，接着28个循环：94°C10秒，60°C1分钟，接着60°C20分钟，接着4 °C。 在扩增之后，PCR产物的显影使用毛细管电泳实施。该结果以图表的形式展示在图1-4中
【主权项】
1. 一种用于扩增核酸的方法，其包含以下步骤： i) 将包含离液盐的固体支持物与含核酸的细胞样品接触， ii) 将所述固体支持物转移至反应容器， iii) 将在固体支持物上的所述核酸与核酸扩增试剂溶液一起孵育， iv) 扩增核酸以产生扩增的核酸， V)定量扩增的核酸和任选地， vi)使用短串联重复（STR)概况分析以产生STR分布图， 其中步骤i)-vi)在固体支持物的存在下实施。
2. 权利要求1的方法，其中在加入所述细胞样品之前所述固体支持物在反应容器中。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述扩增方法是聚合酶链反应。
4. 权利要求1或2的方法，其中所述扩增方法包括逆转录聚合酶链反应、等温扩增或 定量聚合酶链反应。
5. 任何在前权利要求的方法，其中所述核酸扩增试剂溶液包含聚合酶、脱氧核糖核苷 酸三磷酸（dNTP)、反应缓冲液和至少一种引物，其中所述引物任选用染料标记。
6. 任何在前权利要求的方法，其中所述离液盐是胍盐。
7. 权利要求6的方法，其中所述胍盐选自硫氰酸胍、氯化胍和盐酸胍。
8. 权利要求1-5的方法，其中所述离液盐是钠盐例如碘化钠。
9. 任何在前权利要求的方法，其中在步骤i)之后用水性溶液洗涤所述固体支持物。
10. 任何在前权利要求的方法，其中所述固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相 介质、基于塑料的固相介质、基于纤维素的固相介质、玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化 硅、硝酸纤维素、羧甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚 偏二氟乙稀、羊毛和多孔陶瓷。
11. 任何在前权利要求的方法，其中所述固体支持物是基于纤维素的基质。
12. 权利要求11的方法，其中所述基于纤维素的基质呈预冲压圆片的形式。
13. 权利要求11或12的方法，其中所述基于纤维素的基质呈FTA?洗提卡的形式。
14. 用于扩增核酸的方法，其包括以下步骤： i) 将包含裂解试剂的固体支持物与含核酸的细胞样品接触， ii) 将所述固体支持物转移至反应容器， iii) 将在固体支持物上的所述核酸与核酸扩增试剂溶液一起孵育， iv) 扩增核酸以产生扩增的核酸， V)定量扩增的核酸， 其中步骤i)_v)在固体支持物的存在下实施。
15. 权利要求14的方法，其中在加入所述细胞样品之前所述固体支持物在反应容器 中。
16. 权利要求14或15的方法，其中所述扩增方法是聚合酶链反应。
17. 权利要求14-16的方法，其中所述裂解试剂选自表面活性剂、去垢剂和离液盐。
18. 权利要求14-17的方法，其中所述裂解试剂选自十二烷基硫酸钠、硫氰酸胍、盐酸 胍、氯化胍和碘化钠。
19. 权利要求14-18的方法，其中将所述固体支持物用十二烷基硫酸钠（SDS)、乙二胺 四乙酸（EDTA)和尿酸浸渍。
20. 权利要求14-19的方法，其中所述固体支持物呈FTA?预冲压圆片的形式。
21. 权利要求14-20的方法，其中所述固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相介 质、基于塑料的固相介质、基于纤维素的固相介质、玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化硅、 硝酸纤维素、羧甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二 氟乙烯、羊毛和多孔陶瓷。
22. 权利要求14-21的方法，其中在步骤i)之后用水性溶液洗涤所述固体支持物。
23. 任何在前权利要求的方法，其中使用PCR成像系统定量所述扩增的核酸。
24. 任何在前权利要求的方法，其中所述细胞样品选自真核的细胞、原核的细胞、病 毒、细菌、植物和组织培养细胞。
25. 任何在前权利要求的方法，其中所述细胞样品选自血液、血清、精液、脑脊液、滑 液、淋巴液、唾液、口腔的、颈部的细胞、阴道的细胞、尿、粪便、毛发、皮肤和肌肉。
26. 任何在前权利要求的方法，用作选自分子诊断学工具、人鉴别工具和法医学工具 的工具。
27. 任何在前权利要求的方法，其中在步骤ii)之前将所述核酸储存在固体支持物 上。
28. 任何在前权利要求的方法，其中所述核酸在固体支持物上储存至少30分钟。
29. 按照任何在前权利要求的方法扩增核酸的试剂盒和其使用说明书。
【专利摘要】本发明涉及方法和试剂盒，其可用于扩增核酸，优点是减少用户时间和可能的污染。为了便于加工和扩增核酸样品，将样品结合至固体支持物并在无需纯化的情况下在核酸扩增反应例如聚合酶链反应(PCR)中直接使用。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-10
【公开号】CN104769111
【申请号】CN201380058557
【发明人】P.J.塔特内尔, K.L.拉梅顿, A.S.皮尔塞, E.阿斯曼
【申请人】通用电气医疗集团英国有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2013年11月6日
【公告号】EP2917344A1, WO2014072354A1