环境中增殖并形成神经球的特性达到对神经干细胞的分离纯化之目的。形成的神经球经免疫荧光标记测定，表明约93%的细胞为Nestin阳性，说明此方法分离纯化神经干细胞简单有效。经此方法分离纯化的胚胎神经干细胞可以在体外分化形成神经元、少突胶质细胞和神经胶质细胞。
[0021]公开号为CN103849566A的中国专利介绍了一种电兴奋性细胞培养方法包括:静电纺丝电极1、培养皿基底2、电兴奋性细胞3、电刺激模块4、电极连线5。本发明结构简单，可以在基于骨架立体培养的同时加入电刺激，提高可电兴奋性细胞的培养质量。
[0022]公开号为CN201418901的中国专利介绍了一种人工肝用多孔砖式填充支架型反应器，包括反应器外壳；反应器外壳内部由两个密布网格的隔离板分为三个舱:自下而上为氧合舱、填充支架舱、免疫阻隔舱。本实用新型采用独特的多孔砖式固定床作为反应器内部主体，通过固定床中互不相通的细长孔柱分割反应器内部成微型独立单元，将反应器内腔化整为零，减小无效腔、死腔、液流阻力，使反应器内部液流均匀。解决支架型反应器缺乏免疫隔离、氧供不充分的问题，又弥补中空纤维型反应器细胞生长空间不足、细胞黏附性差、缺乏三维立体生长环境、易堵塞半透膜的缺陷。兼具氧合、免疫阻隔、三维立体培养功能，综合性能强大，制作工艺简单、成本低、易于放大。
[0023]公开号为CN101092606的中国专利介绍了一种神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法，包括:选择具有三维立体环境的多孔微载体；对微载体进行预处理，其特征在于:它还包括以下步骤:(1)将含有40-60ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、40-60ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)和B27的DMEM/F12神经干细胞无血清培养液包被上述的微载体，使促进细胞分裂的碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子均匀地渗透于微载体内；(2)将上述处理好的微载体放入细胞培养瓶内，加入上述神经干细胞无血清培养液，然后在培养瓶加入1X105-1X106个神经干细胞，混合均匀后，再充入含有5%浓度的二氧化碳气体，并在37°C左右的恒温下进行培养，根据细胞的增殖情况，每5-7天更换神经干细胞无血清培养液；(3)将长满神经干细胞的微载体从培养瓶中取出，放入含有0.05%胰蛋白酶的D-hank’ s缓冲液中，在室温下消化10-30分钟，去除微载体，漂洗细胞，得到神经干细胞。与传统的培养方法相比，多孔微载体有助于扩大培养面积，碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子促进了细胞的增殖分裂，改善细胞生存的微环境，有利于神经干细胞增殖分裂，达到神经干细胞体外扩增的目的。
[0024]公开号为CN101549179的中国专利介绍了一种人工肝用多孔砖式填充支架型反应器，包括反应器外壳；反应器外壳内部由两个密布网格的隔离板分为三个舱:自下而上为氧合舱、填充支架舱、免疫阻隔舱。本发明采用独特的多孔砖式固定床作为反应器内部主体，通过固定床中互不相通的细长孔柱分割反应器内部成微型独立单元，将反应器内腔化整为零，减小了无效腔、死腔、液流阻力，使反应器内部液流均匀。既解决支架型反应器缺乏免疫隔离、氧供不充分的问题，又弥补中空纤维型反应器细胞生长空间不足，细胞黏附性差，缺乏三维立体生长环境，易堵塞半透膜的缺陷。兼具氧合、免疫阻隔、三维立体培养功能，综合性能强大，而制作工艺简单、成本低、易于放大。
[0025]从目前文献资料来看，在国内外主要以硬质材料如静电纺丝电极、微载体等提供立体培养载体，但是人体环境主要以软体材料构成，并不能模拟人体内环境，大大减缓了药物筛选的速度，也降低了药物筛选的准确度。
【发明内容】
[0026]在药物筛选过程中，药物与细胞直接混合，所有细胞反应是一致的，但是人体代谢过程中药物在各个细胞周围浓度是不致的，各个细胞反应也不相同，为了更好的模拟人体内环境，观察药物对人细胞的影响，为临床提供丰富的实验数据，本发明提供一种立体化培养细胞方法以及在药物筛选过程中的应用。
[0027]本发明采用的技术方案包括:取转瓶培养获得大量人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)、立体基质配制、立体基质进行交联、加入药物进行立体化培养、检测筛选各种药物。
[0028]因此，本发明提供立体化培养细胞在骨科药物筛选中的应用，其具体步骤包括:
[0029](I)转瓶培养获得大量细胞:采用干细胞常规培养方法获得含大量人骨髓间充质干细胞的培养液，经800?100rpm低速离心5_10min得人骨髓间充质干细胞；
[0030](2)立体基质配制和交联:取步骤(I)所获得的人骨髓间充质干细胞1mL放入300mL培养瓶中，再加入10mL的1.2 %巯基化透明质酸水溶液，搅拌5_10min后再加入50mL的15%高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入6孔板中，28-32°C静置12-20min，得含有人骨髓间充质干细胞的立体化培养介质；
[0031](3)与药物立体化共培养:向6孔板中加入含不同浓度药物的细胞培养液，在37°C的CO2培养箱中培养；
[0032](4)镜检观察细胞状态:与不同浓度的药物培养时，每隔2h后直接将培养的6孔板放入倒置显微镜中观察，确定各种药物在不同浓度下细胞生长状态；
[0033](5)筛选药物体系建立:根据显微镜观察的细胞生长状态确定各种药物的浓度，取200mL的1.2%巯基化透明质酸水溶液放入500mL培养瓶中，加入步骤(I)所获得的干细胞10mL，搅拌混合5-10min，10mL的15%高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，进行均匀混合后立即倒入96孔板中，30°C静置15min，向96孔板中加入各种药物在37°C的CO2培养箱中培养，每隔2h后直接将培养的96孔板放入倒置显微镜中观察，快速筛选各种药物的有效性和毒性。
[0034]所述15%高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液和1.2%巯基化透明质酸水溶液，是指质量体积比，用15g高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯用10mLPBS溶液溶解得15%高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，将2.4g巯基化透明质酸用200mLPBS溶液溶解得1.2%巯基化透明质酸水溶液，上述各种溶液是经过膜过滤除菌获得无菌溶液。高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯和巯基化透明质酸可以从广州恩轲肽医药科技有限公司购买。
[0035]所述PBS溶液是指氯化钠NaCl 0.4g、磷酸二氢钾KH2PO40.024g、磷酸氢二钠Na2HPO40.164g、氯化钾 KCl 0.(Hg、碳酸氢钠 NaHCO30.3g 用水配成 100mL。
[0036]所述人骨髓间充质干细胞的培养液是采用低糖DMEM培养基。不同浓度药物的细胞培养液配制:低糖DMEM培养基与不同药物配比组合获得。
[0037]所述药物是指小分子有机物、抗生素、多肽蛋白类药物等水溶性或脂溶性药物。
【附图说明】
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[0038]图1.细胞外基质3D材料成型后外观；
[0039]图2.hBMSCs复合材料在100X倍光学显微镜下形态图；
[0040]图3