)取lOmmol当量的树脂放入多肽合成仪反应器中，加入DCM(二氯甲烷）溶胀 半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个Fmoc保护的氨基酸lOmmol，20mmol的DIEA(二 异丙基乙胺），适量的DMF(二甲基甲酰胺）、DCM溶液(适量是指以可使树脂充分鼓动起来 为宜)，用氮气鼓泡反应60min。然后加入约50_〇1当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用 DMF、甲醇洗净。
[0025] (3)加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测。
[0026] (4)往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为20mmol)，20mmolHBTU(苯并三氮 唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐)及DIEA，氮气鼓泡反应半小时，抽掉液体，用DMF，甲 醇洗净，茚三酮检测。
[0027] (5)重复依步骤3、4的方式依次加入序列中氨基酸，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮 检测。
[0028] (6)将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶 中加一定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液，震荡反应2h，目的是将多肽从树脂载体上裂解下 来并去除氨基酸的侧链保护基团。
[0029] (7)滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清 洗即可得到该序列的粗产物。
[0030] (8)分析提纯和质谱检测：用ESI(电喷雾电离）离子源质谱仪检测该序列分子量 的正确性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。
[0031] (9)收集纯化好的目标寡肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
[0032] 实施例2寡肽对小鼠耳廓肿胀程度的影响，抗炎消肿镇痛的作用
[0033] 取昆明种小鼠，雌雄各半，体重25_30g，按样品量随机分组：每组10只。 HY01-HY24(250mg/kg)(2mg/ml)、萘丁美酮（250mg/kg)、生理盐水对照组（0?lml/10g)粗提 物剂量均折算为原动物生药剂量（下同）。各组均经口灌胃给药，对照组经口灌胃生理盐 水。各组每天灌胃1次，连续4d,末次灌胃2h后，尾静脉注射Evan'sblue50mg/kg,于 小鼠右耳双面涂二甲苯25ul/面，20h后，拉颈处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径 7. 5mm的打孔器分别在双耳同一部位打下圆耳片，电子天平称重，求出重量差，用以表示 肿胀度（肿胀度=左耳耳片重-右耳耳片重）。按以下公式计算肿胀抑制百分率。
[0034]抑制率（%) =(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/对照组平均肿胀度*100%。
[0035]表1
【主权项】
1. 一种寡肽⑶01，其特征在于，由Y、E、H3个氨基酸残基组成，分子量为447. 45Da， 其氨基酸序列如SEQID: 1所示。
2. -种权利要求1所述寡肽的制备方法，其特征在于包括如下的步骤： a. 合成顺序为从C端到N端；取1倍摩尔当量的树脂放入多肽合成仪反应器中，加入 DCM(二氯甲烷）溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个Fmoc保护的氨基酸IOmmol， 2倍摩尔当量的DIEA(二异丙基乙胺），适量的DMF(二甲基甲酰胺）、DCM溶液(适量是指以 可使树脂充分鼓动起来为宜)，用氮气鼓泡反应60min;然后加入约5倍摩尔当量甲醇，反应 半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净； b. 加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测； c. 往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2倍摩尔当量)，2倍摩尔当量HBTU(苯 并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐）及DIEA，氮气鼓泡反应半小时，抽掉液体，用 DMF，甲醇洗净，茚三酮检测； d. 重复依步骤b、c的方式依次加入序列中氨基酸，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检 测； e. 将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一 定量的95%TFA(三氟乙酸）切割液，震荡反应2h，目的是将多肽从树脂载体上裂解下来并 去除氨基酸的侧链保护基团； f. 滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可 得到该序列的粗产物； g. 分析提纯和质谱检测：用ESI(电喷雾电离)离子源质谱仪检测该序列分子量的正确 性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度； h. 收集纯化好的目标寡肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
3. -种如权利要求1所述的寡肽在制备抗炎或镇痛药物中的应用。
4. 一种如权利要求1所述的寡肽在制备修复创面药物中的应用。
5. -种如权利要求1所述的寡肽在制备治疗皮肤外伤药物中的应用。
6. -种如权利要求1所述的寡肽在制备治疗消化道溃疡药物中的应用。
7. -种如权利要求1所述的寡肽在制备提高免疫药物中的应用。
8. 权利要求1所述的寡肽可作为普通食品、保健品或者药品的组成部分。
9. 含有权利要求1所述的一种或多种寡肽的组合物，其中含有药学可以接受的载体。
10. 权利要求9所述的组合物可以以药物制剂形式存在，优选的是注射剂，更优选的是 冷冻干燥注射剂，该药物制剂形式药物组合物，可以按照制剂学常规技术制备，包括将药物 活性成分，本发明的寡肽与药物载体混合，按照制剂学常规技术制成所需要的剂型。
【专利摘要】本发明公开了一个小分子寡肽及其制备方法，具体是寡肽CD01及其制备方法和应用,本发明公开了寡肽的氨基酸序列如SEQ ID:1所示，可以采用合成，提取或者基因工程等方式制备寡肽CD01，在制备治疗抗炎镇痛、创面修复以及提高免疫的药物中有较好的治疗效果。
【IPC分类】A61P17-02, A23L1-305, A61P1-04, A61P37-04, C07K5-087, C07K1-04, A61P29-00, A61K38-05, C07K1-06
【公开号】CN104817618
【申请号】CN201410044246
【发明人】陈光健
【申请人】陈光健
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2014年1月30日