丫RIIIA受体。本文考虑的效应子功能可W选白该样的组，所述组包括，但不限于，增加 的Fc-介导的细胞的细胞毒性；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨瞻细胞的结合；增加 的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的定向信号传导诱导程序性细胞 死亡；增加的树突细胞成熟；和增加的T细胞引发。
[0057] 在另一个方面，本发明设及重组的，嵌合的抗体片段，其具有鼠B-Lyl抗体的结合 特异性并包含化区域，所述抗体片段被进行了改造从而具有由本发明的方法的任一个所 产生的增加的效应子功能。
[005引在另一个方面，本发明设及融合蛋白，其包括具有SEQIDNO;1的序列的多肤和等 价于免疫球蛋白的化区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一方 法所产生的增加的效应子功能。
[0059] 在另一个方面，本发明设及融合蛋白，其包括具有SEQIDNO;3的序列的多肤和等 价于免疫球蛋白的化区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一方 法所产生的增加的效应子功能。
[0060] 在一方面，本发明设及药物组合物，其包括由本发明的任一方法所产生的重组的 嵌合的抗体，和药用载体。在另一个方面，本发明设及药物组合物，其包括由本发明的任一 方法所产生的重组的嵌合的抗体片段，和药用载体。在另一个方面，本发明设及药物组合 物，其包括由本发明的任一方法所产生的融合蛋白和药用载体。
[0061] 本发明还设及治疗可通过B细胞消减来治疗的疾病的方法，所述方法包括将治疗 有效量的通过本发明的方法的任一种产生的重组的，嵌合抗体或其片段施用于需要其的人 受试者。
[0062] 附图简述
[006引图1鼠B-Lyl的Vh区域的核巧酸（SEQIDNO进和氨基酸序列（SEQIDNO;1)。 [0064] 图2鼠B-Lyl的V返域的核巧酸（SEQIDNO;4)和氨基酸序列（SEQIDNO:扣。 [006引图3利妥昔单抗?做和ch-B_Lyl(A)与在RajiB-淋己瘤细胞上的CD20的结 厶 口 0
[006引图4在下列S种不同种类的化丫RIIIa-158V/F基因型的全血中，利妥昔单抗化 (0)和ch-B_Ly1 (A)导致的B细胞消减；(A)来自对于较低亲和性受体纯合的F/F供体的 全血；做来自对于亲和性受体是杂合的F/V供体的全血郝似来自对于较高亲和性受体 纯合的V/V供体的全血。
[0067] 图5嵌合的，抗-CD20抗体的重链的核巧酸（SEQIDNO;11)和氨基酸序列（SEQ IDNO;1：3)。
[0068] 图6嵌合的，抗-CD20抗体的轻链的核巧酸（SEQIDNO;。）和氨基酸序列（SEQ IDNO; 14)。
[0069] 图7鼠B-Lyl抗体CDRs的核巧酸和氨基酸序列。（A)Vh区域的预期CDRs。炬)VL 区域的预期CDRs。
[0070] 图8糖改造的，嵌合B-Lyl抗体的MLDI-T0F模式。（A)详述特异性峰的百分比的 表；炬）糖改造的嵌合B-Lyl的光谱；（C)用化do-H处理的糖改造的嵌合B-Lyl的光谱。
[0071] 图9不同的人源化的抗-CD20抗体与RajiB细胞的结合。在B-H肥构建体和 B-HL8和B-HL11构建体之间的差异存在于构架1和2区域中，其中所有的S个CDRs是相同 的。B-HL8和B-HL11的FRI和FR2序列来自人VH3类，而完整的B-HH2构架是人VH1来源 的。B-HL11是具有单一突变GlulGln的B-HL8的衍生物，其中Gin是B-H肥构建体的氨基 酸残基。该意味着GlulGln交换没有改变结合亲和性或强度。在B-HH2和B-HL8之间的其 它差异是14FR残基，其中一个或多个将影响该抗体的抗原结合行为。
[0072] 图10在Raji祀细胞上的人源化的抗-CD20抗体肌L4-KV1的结合。通过用人种 系序列VH1_45的FR1替换B-H肥的FR1，该B-HL4构建体来源自B-H肥抗体。该构建体显 示大大减少的抗原结合能力，尽管在FRI中的仅S个位点上具有不同的氨基酸。该些残基 位于按照K油at编号方式的位点2,14,和30处。其中，位点30似乎是最有影响的位点，因 为其是CDR1的化othia限定的部分。
[0073] 图11.在皿2，B-H册和母体抗体B-lyl之间的结合行为的比较。该数据 显示所有的Abs显示相似的EC50值，但是与变体B-H肥和B-H册相比，B-HH1构建体W更 低的强度/化学计量结合。B-HH1可W通过其部分人CDR1和CDR2区域化油at定义），W 及在位点28化油at编号方式）上的Ala/T虹多态性，与B-H肥和B-H册区分。该显示位点 28,完整的CDR1，和/或完整的CDR2的任一对于抗体/抗原相互作用是重要的。
[0074] 图12B-HL1，B-HH1，和B-lyl母体抗体的比较。该数据显示在B-HL1构建体中的 任何结合活性的缺乏，和与B-lyl相比，大约一半的B-HH1结合强度/化学计量。B-HL1W 及B-HH1两者，基于来自人VH1类的受体构架进行设计。在其它的差异中，B-HL1的位点 71化油at编号方式）构建体是显著的差异，显示其对于抗原结合的推定的重要性。
[00巧]图13抗-CD20抗体与其抗原的capaicty的巧光细胞计量（Fluoroc5ftomet;ric) 分析。该数据显示B-HL2和B-HL3构建体没有显示CD-20结合活性。
[0076] 图14在Z-138M化细胞上的抗-CD20抗体的程序性细胞死亡。
[0077] 图15抗-CD20抗体导致程序性细胞死亡。巧憶详述；将5x105细胞/孔接种在 24孔板巧X105细胞/ml)的培养基中。将用于阴性对照的lOmg的各个Ab，PBS或5mM喜 树碱仰T)阳性对照加入孔中。将样品温育o/n(16小时），用AnnV-FITC染色，并通过FACS 进行分析。测定次重复进行（*);减去对于单独的PBS的信号（单独的PBS对于PR-1 和Z-138细胞分别给出8%和2%的AnnV+)。所用的抗体是；C2B8 (嵌合的，非糖改造的）； B皿2-KV1 (人源化的，非糖改造的）。注意；该测定不包括任何另外的效应细胞，仅是祀加上 抗体或对照。
[0078] 图16W免疫效应细胞造成的抗-CD20抗体的祀细胞杀伤。测定详述；在过夜温育 的正常全血细胞中的B细胞消减和通过FACS分析CD19+/CD3+。使用PBMCs作为效应物的 ADCC，4小时温育，25 : 1的效应物；祀标比率，通过巧巧光素-保留相对于去污剂-裂解 (100% )和无Ab的裂解（0% )测量的祀标杀伤。所用的抗体;C2B8(嵌合的，非糖改造形 式）巧皿2-KVl-wt炬皿2-KV1的人源化的，非糖改造形式）；B皿2-KV1-GE炬皿2-KV1的人源 化的，非糖改造形式）。
[0079] 图17未修饰的，非糖改造的B皿2-KV1人源化的IgGlB-lyl抗-人CD20抗体的 PNGaseF-释放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。
[0080] 图18糖改造的B皿2-KVlgl人源化的IgGl B-lyl抗-人CD20抗体的PNGaseF-释 放的Fc-寡糖的MLDI/T0F-MS模式。糖改造通过在宿主细胞中的抗体基因和编码具有 0 -1，4-N-己酷葡糖胺转移酶III KnT-III)催化活性的酶的基因的共表达来进行。
[00引]图19糖改造的B皿2-KVlg2人源化的IgGlB-lyl抗-人CD20抗体的PNGaseF-释 放的Fc-寡糖的MLDI/T0F-MS模式。糖改造通过在宿主细胞中的抗体基因和编码具有 e-l，4-N-己酷葡糖胺转移酶III佑nT-III)催化活性的酶的基因W及编码具有高尔基体 a-甘露糖巧酶II催化活性的酶的基因的共表达来进行。
[0082] 图20非糖改造和糖改造的抗体与在重组CH0-CD16细胞表面展示上的人 化丫Rllla受体的结合。
[0083] 图21非-化改造的和化改造的抗-CD20抗体对Z-138M化细胞造成的程序性细 胞死亡。测定详述；将5x105细胞/孔接种在24孔板巧X105细胞/ml)的培养基中。将 用于阴性对照的lOmg的各个Ab，PBS加入孔中。将样品温育o/n(16小时），用AnnV-FITC 染色，并通过FACS进行分析。测定次重复进行。所用的Abs;C2B8=利妥昔单抗（嵌 合的，非糖改造形式，与商业形式相同）；B皿2-KV1 (人源化的，非糖改造的-见图6糖基化 模式）巧皿2-KVlgl(人源化的，糖改造的-见图7糖基化模式）；B皿2-KVlg2 (人源化的，糖 改造的-见图8糖基化模式）。注意；该种测定不包括任何另外的效应细胞，仅是祀标加抗 体或对照。（*);减去单独的PBS的信号。
[0084] 发明详述
[0085] 本文所用的术语如本领域通常所用的，除非如下另外指出。
[0086] 用于本文时，术语抗体意欲包括整个抗体分子，W及具有化区域并保留结合特异 性的抗体片段，和融合蛋白，所述融合蛋白包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域并保留 结合特异性，所述整个抗体分子包括单克隆抗体，多克隆抗体和多特异性（例如，二特异 性）的抗体。还包括人源化，primatized和嵌合的抗体。
[0087] 用于本文时，术语化区域意欲指IgG重链的C-末端区域。尽管IgG重链的化区 域的范围可W轻微变化，人IgG重链化区域通常限定为从位点切S226的氨基酸残基延伸 到駿基末端一段。
[008引用于本文时，术语"等价于免疫球蛋白的化区域的区域"意欲包括免疫球蛋白的Fc区域的天然存在的等位基因变体W及具有改变的变体，所述改变产生置换，添加，或缺 失，但是基本不会减少免疫球蛋白介导效应子功能（诸如抗体依赖性的细胞的细胞毒性） 的能力。例如，在免疫球蛋白的化区域的N-末端或C末端可W缺失一个或多个氨基酸，而 基本不丧失生物学功能。可W按照本领域已知的一般规则来选择该些变体从而对活性具有 最小的影响。（见，例如Bowie, J.U.et al.，Science247:1306-10(1990)。
[0089]用于本文时，在其最广义上讲，术语抗原结合分子指特异性结合抗原决定簇的分 子。更具体地，结合CD20的抗原结合分子是特异性结合35, 000道尔顿的细胞表面的非糖 基化磯蛋白的分子，所述细胞表面的非糖基化磯蛋白典型地指通常被称为CD20的人B淋己 细胞限制性分化抗原化35。所谓"特异性结合"指结合对于抗原是选择性的并且可W与不 需要的或非特异性相互作用区别开。
[0090] 用于本文时，当用在设及多肤诸如ABMs中时，术语融合的和嵌合的，指该样的多 肤，所述多肤包括来自两个或更多异源多肤的氨基酸序列，诸如来自不同物种的抗体的部 分。例如，对于嵌合ABMs而言，非抗原结合成分可W来自广泛种类的物种，包括灵长类动物 诸如黑猩猩和人。最优选嵌合ABM的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同；最优选嵌合 抗体的可变区与重组抗CD-20抗体的可变区基本相同，所述抗CD-20抗体具有鼠B-Lyl的 可变区的氨基酸序列。人源化的抗体是融合或嵌合抗体的特别优选的形式。
[0091] 用于本文时，具有"GnTIII活性"的多肤指该样的多肤，所述多肤能够催化W 0 -1-4连接将N-己酷基葡糖胺佑IcNAc)残基添加到N-连接的寡糖中的S甘露糖基粉。 的0连接的甘露糖巧上。该包括融合多肤，所述多肤显示类似于但不必须相同于，0 (1， 4)-N-己酷葡糖胺转移酶III的活性的酶活性，如在特别的生物测定中所测量的，具有或不 具有剂量依赖性，按照国际生化和分子生物学命名委员会（NC-IUBMB)，其也被称为0-1， 4-甘露糖基-糖蛋白4-0-N-己酷基葡糖胺基-转移酶巧C2.4. 1.144)。在其中确实存 在剂量依赖性的情形中，其不需要与GnTIII的剂量依赖性相同，但是与GnTIII活性相比， 基本类似于在给定活性中的剂量依赖（即，相对于GnTIII，候选多肤将显示更大的活性或 不超过约25倍更少，并且优选地，不超过约10倍更少的活性，并且最优选地，不超过约=倍 更少的活性）。
[0092] 用于本文时，术语变体（或类似物）指通过使用，例如重组DNA技术产生的氨基酸 插入，缺失，和置换而与本发明特别陈述的多肤区别开的多肤。本发明的ABMs的变体包括 嵌合的，primatized或人源化的抗原结合分子，其中氨基酸残基的一个或数个通过