凝胶，放入1.5 mL离心管中，使用TIANGEN胶回收纯化试剂盒进行目的片段回收。
[0022]参照《分子克隆实验指南》，将所得到的PCR产物连接到ρΕΤ32 α (+)载体上，再转化到万.coil DH5 α中(相关试剂均购自宝生物工程有限公司)。挑取质粒经琼脂糖凝胶电泳验证插入片段大小正确后，挑取克隆子交上海生工测序。所得AAur_2040基因序列如SEQID N0.1所示，其相应氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。登录美国生物技术信息中心(NCBI)数据库进行基因序列比对。
[0023]结果显示，同AAur_2040编码基因序列同源性最高的是91% (CP000474.1)，且CP000474.1指代基因未见其关于SW降解的报道。同AAur_2040氨基酸序列同源的蛋白最高序列同源性为 98% (WP_011774729.1 和 WP_026540574.1)，且 WP_011774729.1 和WP_026540574.1所指代的脱氢酶未见其关于SW降解的报道。
[0024]实施例3 Sff降解酶AAur_2040基因在大肠杆菌中的表达 3.1构建表达载体
将实施例2中含有AAur_2040基因的载体ρΕΤ32 α (+)转化到感受态E.coil BL21 (DE3)表达菌中，涂布到含50 μ g/mL氨苄青霉素的选择性平板培养基上过夜培养，随机挑取3个单菌落，接种于3个装有LB液体培养基(含50 μ g/mL氨苄青霉素)的试管中，培养至菌密度达到OD6c?为0.6时，提取质粒，用EcoR\和Hand III双酶切(图2)和测序的方法来检测转化结果。成功转入pET32a (+)-AAur_2040质粒的大肠杆菌为阳性转化子，即为B.coil BL 21(DE3)/ ρΕΤ32 α (+)/AAur_2040。
[0025]3.2诱导表达
W B.coil BL 21 (DE3) / ρΕΤ32 α (+)-AAur_2040 转化子培养于 2 mL LB 培养液(含50 μ g/mL 氨苄青霉素)中，26°C，220 r/min,当 OD6J直达到 0.5 后，添加 0.4 mmol/L 的 IPTG诱导表达过夜。离心收集菌体沉淀，用去离子水清洗菌体。然后用细胞超声破碎仪破碎菌体细胞，500 W超声10 min，开2 S，停3 S。再12 000 g离心10 min，除去细胞残渣，取上清液，即为重组表达的AAur_2040粗酶液。
[0026]3.3重组AAur_2040粗酶液SDS-PAGE蛋白电泳检测
取步骤3.2中得到的粗酶液40 yL，加10 μ L样品溶解液，煮沸10 min，取20μ L点样，进行SDS-PAGE电泳分析，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12%，电泳结束后用考马斯亮蓝染色。结果如图3所示，SW降解酶AAur_2040基因能在万.coi7 BL 21 (DE3)/PET32 a (+)-AAur_2040中大量的诱导表达；与未诱导的对照组相比，诱导组中出现一条明显的蛋白条带位置在(60 KDa左右)，与预测的蛋白大小一致。
[0027]SDS-PAGE蛋白电泳分离胶配方:40mL 30%丙烯酰胺；25mL分离胶缓冲液(pH8.8) ；lmL 10% (m/v)十二烷基苯磺酸钠(SDS) ; 50 μ L TEMED ;750 μ L 10% (m/v)过硫酸铵和 33.2 mL H2O0
[0028]SDS-PAGE蛋白电泳浓缩胶配方:6.7mL 30%丙烯酰胺；10mL浓缩胶缓冲液(pH6.8)；0.4mL 10% (m/v) SDS ；40 μ L TEMED ；200 μ L 10% (m/v)过硫酸铵和 22.7 mL H2O0
[0029]样品溶解液:lmL浓缩胶缓冲液(pH 6.8) ；0.8 mL 甘油；1.6 mL 10% SDS ；0.4 mL2-巯基乙醇；0.2 mL l%(m/v)溴酚蓝。
[0030]电极缓冲液:30 g Tris, 144 g甘氨酸，10 g SDS，加蒸馏水定容至I L，使用前稀释10倍。
[0031]染色液:400 mL水中加入500 mL甲醇，100 mL醋酸，I g考马斯亮蓝R-250。
[0032]脱色液:冰乙酸75 mL,甲醇50 mL，加入蒸馏水定容至I L。
[0033]实施例4重组菌对SW的生物降解实验
将实施例3中重组菌E.coil BL 21 (DE3) / ρΕΤ32 α (+) -AAur_2040培养于LB培养液(含50yg/mL氨苄青霉素)中，26°C，220 r/min，当OD6cJ直达到0.5后，添加0.4 mmol/L的IPTG诱导表达过夜。3000 g离心5 min取菌体，用无菌蒸馏水清洗I次，接入含5% SW的水溶液中(OD6tltl约为0.8)再培养16 h，以空载体E.coil BL 21 (DE3)/ ρΕΤ32 α (+)为对照。收集上清，用气相色谱法测定SW含量，并计算降解率。
[0034]结果如图4和图5，AAur_2040基因的成功导入，使原本不具有降解SW能力的E.coil BL 21 (DE3) / pET32 a (+)，获得了降解Sff的能力，经计算Sff降解率为50.5%。
[0035]以上所述的实例只是本发明的一种较佳方案，并非对本发明做任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1.一种苦马豆素降解酶的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列为SEQ IDN0.1o
2.—种权利要求1所述的基因所编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列为SEQN0.2ο
3.—种重组质粒，其特征在于，该重组质粒中含有权利要求1所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，该重组质粒的载体为ρΕΤ-32α (+)。
5.权利要求1所述的编码基因、权利要求2所述的蛋白、权利要求3所述的重组质粒在降解疯草毒素苦马豆素中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术及酶基因工程领域，涉及一种苦马豆素降解酶的编码基因及其应用。一种苦马豆素降解酶的编码基因（基因AAur_2040），其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。一种所述的编码基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明从能够有效降解苦马豆素的Arthrobacter sp.HW 08中克隆得到负责苦马豆素降解的基因片段—AAur_2040。本发明能够为苦马豆素降解提供有效的生物技术手段，对于动物采食疯草引起的中毒修复具有重要意义。
【IPC分类】C12N15-70, C12N1-21, C12N9-02, C12N15-53, A23L1-015, C12N15-11
【公开号】CN104845987
【申请号】CN201510025831
【发明人】王妍, 李勤凡, 翟阿官, 王建华
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年1月20日