具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法_2

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蛋白激酶代表一个超家族,并且该超家族的成员催化ATP的磷酸酯基团可逆转移 至靶多肽上的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸氨基酸侧链。尤其,蛋白酶的酪蛋白激酶I(CKI)家 族(EC 2.7. 11. 1)作为大多数真核生物中信号转导途径的调节物发挥作用。在酵母中, CK I参与调节DNA修复和细胞周期进展(Hoekstra MF等人,Science 253:Brockman JL 等人,Proc. Natl Acad Sci.USA 89:9454-9458, 1992 ;Dhillon N 和 Hoekstra MF, EMBO J13:2777-2788, 1994)。酪蛋白激酶I蛋白是含有高度保守的中央激酶结构域的丝氨酸 /苏氨酸型单体蛋白激酶。该家族的成员具有趋异的氨基端延伸和羧基端延伸。氨基端 区域负责底物识别并且羧基端延伸对于该激酶与底物相互作用是重要的。还认为羧基端 延伸对于通过自体磷酸化介导调节作用是重要的(Gross和Anderson, 1998Cell Signal 10:699-711 ;Craves 和 Roach, 1995,J Biol Chem 270:21689-21694)。
[0028] 在植物中,几种CKI蛋白家族成员已经克隆并以生物化学方式表征(Klimczak和 Cashmore AR, 1993. Biochem. J. 293:283-288 ;Liu 等人 2003, Plant Journal. 36, 189-202 ; Lee等人2005Plant Cell. 17 (10) : 2817 - 2831)。发现拟南芥属基因组含有至少14种酪蛋 白激酶I样(CKL)基因。在保守的激酶结构域范围内,所述多肽共享在氨基酸水平的89%序 列相似性。这14种拟南芥CKL同种型已经基于亚细胞定位进一步分类在3个组中。组1主要 位于细胞周边;组2主要在细胞核中并且组3主要在细胞浆中。烟草(Nicotiana tabacum) CKI已经被定位于胞间连丝并且提出其在细胞间通讯中发挥作用(Lee等人2005)。对植物 CKI提出的其他作用是应答于环境刺激的信号转导、根发育和植物激素敏感性(Liu等人)。
[0029] 出人意料地,现在已经发现:调节编码CKI多肽的核酸表达产生了相对于对照植 物具有增强的产量相关性状的植物。
[0030] 根据一个实施方案,提供了用于相对于对照植物而言改善植物的产量相关性状的 方法,包括调节植物中编码CKI多肽的核酸表达。改善的产量相关性状包含以下一项或多 项:提高的生物量、增加的出苗生长势和提高的种子产量。
[0031] IV.植物同源域指-同源域(PHDf-HD)多肽
[0032] 转录因子通常定义为显示序列特异性DNA结合亲和力并且能够激活和/或阻遏 转录的蛋白质。拟南芥基因组编码至少1533种转录调节蛋白,占其预计基因总数的约 5.9% (Riechmann 等人(2000)Science 290:2105-2109)。稻转录因子数据库(DRTF)是籼 稻(Oryza sativa L. ssp. indica)和梗稻(Oryza sativa L. ssp. japonica)的已知和预 测转录因子的集合,并且目前含有籼稻中的2, 025种推定转录因子(TF)基因模型和粳稻 中的2, 384种推定转录因子基因模型,分布在63个家族中(Gao等人(2006) Bioinformati cs2006, 22(10):1286-7)。
[0033] 这些家族之一是参与发育过程多方面的同源域(HD)转录因子超家族。HD转录因 子的特征是存在同源域(HD),该结构域是一个60氨基酸DNA结合结构域(BD)。拟南芥和 稻大约含有100种HD转录因子,所述转录因子可以基于氨基酸序列同一性进一步划分成亚 家族(Richardt 等人(2007) Plant Phys 143 (4) : 1452 - 1466)。这些亚家族中的一些亚家 族以存在促进DNA结合和/或蛋白质-蛋白质相互作用的额外的保守结构域为特征。
[0034] 这些结构域之一是PHD指,因为与相同多肽上的DNA结合HD结合而得名的植 物同源域指(PHDf ),其中所述的PHD指最初因玉米同源框转录因子ZmHOX I a (Be I Iman和 Werr(1992)EMB0 J 11:3367-3374)和其拟南芥属近亲 ATHAT3. USchindler 等人(1993) Plant J 4:137-150)之间的氨基酸序列同一性而鉴定。PHDf是能够螯合两个锌离子的 Cys4-His-Cys3锌指样基序。PHDf存在于胞核蛋白质中并且认为其参与染色质介导的转录 调节(Halbach 等人(2000) Nucleic Acid Res 28(18) :3542-3550)。
[0035] 联合有PHDf和HD的转录因子因而称为PHDf-HD (上文的Halbach等人(2000))。 在植物中,此类PHDf-HD进一步以PHDf上游存在亮氨酸拉链(ZIP)为特征。这两种结构域 (ZIP和PHDf)共同形成一个称作ZIP/PHDf结构域的高度保守的180氨基酸区域(上文的 Halbach 等人(2000))。
[0036] 使用与ω增强子组合的花椰菜花叶病毒35S启动子强烈过量表达两种玉米 PHDf-HD多肽(ZmHOXla或ZmHOXlb)之一的转基因烟草植物显示相同的形态学变化:大小 减小、形成不定根和同源异型花转变(Uberlacker等人(1996)Plant Cell 8:349-362)。 与野生型相比,使用花椰菜花叶病毒35S启动子强烈过量表达稻(Oryza sativa) HAZ1PHDF-HD多肽的转基因稻植物和烟草植物不显示异常生长或表型变化(Ito等人 (2004)Gene 331:9-15)。
[0037] 在美国专利7, 196, 245中,将拟南芥PHDf-HD多肽(鉴定为G416)转化到拟南芥 中,并且证明与对照植物相比,其促进转基因植物中早期开花,而对种子产量无影响。
[0038] 出人意料地,现在已经发现:调节、优选地增加编码PHDf-HD多肽的核酸序列表达 产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状、优选增强的种子产量相关性状的植物。
[0039] 根据一个实施方案,提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状、优选 增强种子产量相关性状的方法,包括调节、优选地增加植物中编码PHDf-HD多肽的核酸序 列表达。增强的产量相关性状、优选增强的种子产量相关性状包含以下一项或多项:增加的 原发花序(primary panicle)数、每株植物提高的总种子产量、提高的(充实)种子数、提 高的千粒核重(TKW)、提高的收获指数。
[0040] V. bHLHl 1样(碱性螺旋-环-螺旋11)蛋白
[0041] 转录因子通常定义为显示序列特异性DNA结合作用并且能够激活和/或阻遏转录 的蛋白质。碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族是最大的转录因子家族之一,已经在拟南芥 中表征(Toledo-Ortiz 等人,Plant Cell 15, 1749-1770, 2003 ;Bailey 等人,Plant Cell 15,2497-2501,2003)和已经在稻中表征(Li 等 Plant Physiol. 141,1167-1184, 2006)。 bHLH转录因子家族的区别性特征是存在由大约60个氨基酸构成的二分结构域。这种二分 结构域由与共有的六核苷酸E盒相结合的DNA结合碱性区域和在该区域羧基末端存在的 两个α-螺旋构成,其中所述的两个α-螺旋由可变环区隔开。这两个α-螺旋促进二聚 化,允许不同家族成员之间形成同二聚体和异二聚体。尽管bHLH结构域是进化保守的,然 而除这个结构域之外,进化枝之间存在很少序列相似性。基于bHLH结构域的序列,Li等人 (2006)将稻和拟南芥bHLH转录因子分成22个亚家族。
[0042] 有关bHLHl 1样多肽在植物中的功能知之甚少。迄今,已经表征仅一种bHLHl 1样 多肽,即来自稻的OsPTFl。据报道OsPTFl参与针对磷酸盐饥饿的耐受性(Yi等人,Plant Physiol. 138, 2087-2096)。与对照植物相比,在35S启动子控制下过量表达这种基因的稻 植物在正常条件下培育时没有显示任何不同的表型,但是在磷酸盐限制条件下,该植物具 有改善的磷酸盐摄取。在磷酸盐限制条件下,转基因植物显示生物量增加、磷酸盐含量提 高、分蘖增加和种子产量提高。
[0043] 出人意料地,现在已经发现:在植物中调节编码bHLHll样多肽的核酸表达产生了 相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其提高的产量的植物。这些作用在磷酸盐不 限制的生长条件下显示。
[0044] 根据一个实施方案,提供了用于相对于对照植物而言改善植物的产量相关性状的 方法,包括调节植物中编码bHLHll样多肽的核酸表达。这种改善的产量相关性状包含提高 的种子产量。
[0045] VL ASR(脱落酸、胁迫和成熟诱导的)蛋白
[0046] ASR(脱落酸、胁迫和成熟诱导的)多肽首先在番前中(Iusem等1993Plant Physiol 102:1353-1354)鉴定为定位至细胞核并与染色质结合的小的高度带电荷的亲水 性蛋白质。编码ASR多肽的Asr基因家族广泛存在于高等植物中,并且ASR同源物已经从 大量双子叶和单子叶植物克隆(Carrai等人2004Trends Plant Sci 9:57 - 59)。大多数 Asr基因在不同环境胁迫条件下、在果实成熟期间和用激素 ABA处理细胞时上调。ASR多肽 显示高度的序列保守性(Frankel等人2006. Gene第74-83页)。全部已知的Asr基因含 有两个高度保守的区域。第一区域含有在氨基端的一串His残基,具有序列特异的Zn 2+-依 赖DNA结合活性(Kalifa等人,2004a Biochem J381:373 - 378)。第二区域是羧基端序列 的庞大部分,经常含有核定位信号NLS (Cakir等人,2003Plant Cell 15:2165 - 2180)。番 茄的ASRl蛋白是内在非结构的蛋白质,其在结合锌离子时变得有序(折叠)并且形成二聚 体(Goldgur 等人 Plant Physiol. 2007 年2 月;143 (2) :617-28)〇
[0047] 已经提出ASR多肽在调苄基因转录中的推定作用。据报道,酵母单杂交实验揭示 一种葡萄ASR与己糖转运蛋白基因(VvHTl)的启动子结合。与此一致,已经提出了 Asrl在 异养器官(如马铃薯块茎)中控制己糖摄取的作用(Frankel等人Plant Mol Biol. 2007年 3月;63(5) :719-30)。已经报道了 ASR家族的蛋白质成员的锌依赖性DNA结合活性(Kalifa 等人 2004Biochem J. 2004 年 7 月 15 日;381(Pt 2):373-8)。ASRl 蛋白的 DNA 结合结构域 和锌结合结构域已经定位(Rom等人2006. Biochimie. 88 (6) : 621-8 ;Goldgur等人2007. Plant Physiol.2 月;143(2):617-28)。
[0048] 已经公开了使用ASR多肽改善植物中的农学性状作为增强植物针对特定非生物 胁迫的耐受性的方法。例如,在拟南芥属植物(拟南芥)中过量表达来自百合(麝香百合 (Lilium Iongiflorum))的ASRl直向同源物LLA23基因提高植物针对干旱和盐度的耐受性 (¥已叩等人2005.?13拉?1^8丨〇1139:836 - 846)。另外,美国专利7,154.025公开了用于通 过增加植物中ASR蛋白的量提高对缺水胁迫的抗性的方法。
[0049] 出人意料地,现
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