[0109]
[0112] b)体外扩增伪狂犬病毒TK基因上游同源臂TKhml和下游同源臂TKhm2,纯化回收 序列如 SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 7 所示；
[0113] 反应体系如下：
[0114]
[0115] 反应程序：
[0118] c)体外扩增GFP基因，纯化回收，序列如SEQ ID NO. 8所示；
[0119] 反应体系如下：
[0120]
[0121] 反应程序：
[0122]
[0123] d)体外扩增mCherry基因，纯化回收，序列如SEQ ID NO. 9所示；
[0124]
[0127] e)酶切连接将GFP基因连入线性化的IoxP载体，如图4所示；
[0128] f)酶切连接将mCherry基因连入线性化的IoxN载体，如图5所示；
[0129] g) PRC 体外扩增得到 IoxP-GFP-IoxP 片段；
[0130] 反应条件：
[0134] h) PCR 体外扩增得到 loxN-mCherry-loxN 片段；
[0135]
[0139] i)融合 PCR 扩增得到 gEhml-loxP-GFP-loxP-gEhm2,序列如 SEQ ID NO. 10 所示； 融合 PCR 扩增得到 TKhml-loxN-mCherry-loxN-TKhm2,序列如 SEQ ID NO. 11 所示；
[0140] 反应条件
[0141]
[0142] 反应程序：
[0143]
[0144] 5、细胞培养和CRISPR/Cas9系统的转染
[0145] a)将293T细胞置于1640培养基进行培养（含胎牛血清10 %、青霉素 lOOU/ml和 链霉素 lOOU/ml);待细胞长满后，胰酶消化、吹散，接种于12孔板，待细胞汇合度到70~ 80 %后进行转染；
[0146] b)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将同源重组片段与SgRNA表达载体混合转 染，
[0147] 优选的，转染量比例为：gEhml-loxP-GFP-loxP-gEhm2 片段、 TKhml-loxN-mCherry-loxN-TKhm2 片段、gE-sgRNA 载体和 TK-sgRNA 载体=0· 5 : 0· 5 : 2 : 2,30(^1^转染液37°〇孵育6~811;
[0148] 6、病毒的感染和重组
[0149] a)转染细胞孵育完成后，感染伪狂犬病毒野毒株（moi = 0. 1、1和10)，300 yL病 毒液37 °C孵育Ih后补液；
[0150] b)培养18~36h后，在显微镜下观察，出现有红色和绿色两种荧光的细胞病变斑 之后，收取细胞液，液氮反复冻融3次，离心后取上清，-80°C保存，如图6所示：
[0151] gE-sgRNA、TK-sgRNA、gE基因同源重组片段、TK基因同源重组片段共转染293T细 胞后，8-12h后接种伪狂犬病毒，18-24h在荧光显微镜下可观察到同时显示绿色荧光（GFP) 和红色荧光（mCherry)的细胞病变斑（图6D)，红箭头指示细胞病变斑（图6C)。
[0152] 7、重组伪狂犬病毒的纯化
[0153] a)将PK-15细胞置于用DMEM培养基中进行培养（含胎牛血清10%、青霉素100U/ ml、链霉素100U/ml);待细胞长满后细胞长满后，胰酶消化、吹散，接种于6孔板。待细胞汇 合度到80-90 %后，接种初代重组毒；
[0154] b)然后按不同稀释梯度接种初代重组毒（10-3、10'10'10'10'KT8)，600 μ L稀 释病毒液37°C孵育Ih ;
[0155] c)孵育完成后吸弃培养液，将2XDMEM(4%胎牛血清，青霉素200U/ml和链霉素 200U/ml)与1. 6 %的低熔点琼脂糖等体积混匀，每孔覆盖2. 5~3mL，置于4°C IOmin使琼 脂糖完全凝固后，37°C CO2培养箱培养；
[0156] d) 48~72h后，在荧光显微镜下观察显绿色和红色两种荧光的噬斑，挑取噬斑融 入200 μ L的DMEM无血清培养基，液氮反复冻融3次后，再接种长满PK细胞的12孔板，扩 增病毒，如图7所示：
[0157] 利用琼脂糖培养板，在荧光显微镜下挑取同时显示绿色荧光（GFP)和红色荧光 (mCherry)的单克隆细胞空斑（图7D);
[0158] f)80%细胞出现病变之后，收取细胞液，液氮反复冻融3次，继续接种低熔点琼脂 糖培养板、挑斑；
[0159] 8、PCR鉴定重组毒的纯化
[0160] 挑斑3-4代后，提病毒基因组进行PCR鉴定，根据鉴定结果确定是否继续下一轮纯 化，鉴定引物序列如下所示。
[0161]
[0162] 具体步骤如下：
[0163] a)收获细胞病毒液，冻融3次后，吸取200 μ L病毒液，加入细胞裂解液 (10 μ L10% SDS，10 μ L0. lmol/LEDTA，1 μ L蛋白酶Κ)，混匀后58°C孵育2h，剩余细胞病毒液 置于-80°C保存；
[0164] b)用等体积的酷：氯仿：异丙醇（25 : 24 : 1)抽提2次，12000r/min离心 IOmin ；
[0165] c)上清加 3moL/L醋酸钠 20 μ L和无水乙醇500 μ L，-20°C作用30min ;
[0166] (1) 1200〇1'/111；[11离心10111；[11，弃上清，沉淀用75%乙醇洗1次，真空干燥；
[0167] e)沉淀溶解于30~50 μ L灭菌CldH2O，作为PCR鉴定反应的模板；
[0168] f)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经鉴定伪狂犬病毒gE基因和TK基因都为阴 性，而能扩出gEhm和TKhm，表明重组毒已经纯化，用PK-15细胞扩大培养后，-80°C保存，如 图8所示：
[0169] 8、Cre/lox系统的转染和双基因缺失毒株的获取
[0170] a)用12孔板接种293T细胞，待汇合度至70~80%，按磷酸钙转染法或脂质体转 染法转染Cre重组酶表达载体，300 μ L转染液体系37°C孵育6~8h ;
[0171] b)吸弃转染液，细胞培养6-12后，按不同MOI接种已纯化的伪狂犬病毒重组毒 (moi = 0. 1、1或10)，300 μ L病毒液37°C孵育Ih后，培养液补加700 μ L培养液继续培养；
[0172] c)培养24~36h后，Cre重组酶的作用能将GFP基因和mCherry基因从伪狂 犬病毒重组毒基因组中切除，在荧光显微镜下能观察到不显绿色荧光（GFP)和红色荧光 (mCherry)的细胞病变斑，收取细胞病毒液，液氮反复冻融3次，离心后收上清；
[0173] d)按不同稀释梯度（ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ6)在长满PK-15细胞的6孔板接 种病毒液，600 μ L病毒液37°C孵育Ih ;
[0174] e)孵育完成后吸弃培养液，将DMEM(4%胎牛血清，青霉素200U/mL和链霉素200U/ mL)与1. 6 %的低熔点琼脂糖等体积混匀，每孔覆盖2. 5~3mL，置于4°C IOmin使琼脂糖完 全凝固后，37°C CO2培养箱培养；
[0175] f) 48~72h后，在荧光显微镜下观察到不显红色荧光和红色荧光的噬斑，挑取噬 斑融入200 μ L无血清DMEM培养基，液氮反复冻融3次后，再接种长满PK细胞的12孔板， 扩增病毒；
[0176] g)80%细胞出现病变之后，收取细胞液，液氮反复冻融3次，继续接种低熔点琼脂 糖培养板、挑斑；挑斑3~4代后，确定在荧光显微镜下再看不到荧光，提病毒基因组进行 PCR鉴定；具体步骤如下：
[0177] (1)收获细胞病毒液，冻融3次后，吸取200 yL病毒液，加入细胞裂解液 (10 yL10% SDS，10 yLO. ImoL/LEDTA，I yL Proteinase K)，混匀后 58°C 孵育 2h。（剩余细 胞病毒液置于_80°C保存）；
[0178] (2)用等体积的酚：氯仿：异丙醇（25 : 24 : 1)抽提2次，12000r/min离心 IOmin ；
[0179] (3)上清加3moL/L醋酸钠20 μ L和无水乙醇500 μ L，-20°C作用30min ;
[0180] (4) 1200〇1'/111；[11离心10111；[11，弃上清，沉淀用75%乙醇洗1次，真空干燥；
[0181] (5)沉淀溶解于30~50 μ L灭菌CldH2O，作为PCR鉴定反应的模板；
[0182] (6)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经鉴定伪狂犬病毒gE基因和TK基因都为阴 性，而能扩出gEhm和TKhm，表明已纯化得到伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株，用PK-15细胞扩 大培养后，_80°C保存，如图9所示：
[0183] 结果显示1号和3号样品gE基因检测引物和TK基因检测引物都没有扩出条带， 说明得到gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株。
[0184] 实施例2伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株PRV-HNX-gE_/TK_动物攻毒试验
[0185] 1、小鼠攻毒试验
[0186] 1)试验鼠从武汉市湖北省疾控中心购得5周龄C57小鼠。
[0187] 2) 15只C57试验小鼠分3组，每组5只，分别右大腿皮下注射等体积量DMEM细胞 培养液、PRV-HNX 病毒液 104_7TCID5(I、PRV-HNX-gE7TIT疫苗株 10 4 7TCID5tl，并分别记为 DMEM 组、PRV-HNX 组和 PRV-HNX-gE_/TK_组。
[0188] 3)48~96h后，PRV-HNX组小鼠发病死亡，DMEM组和PRV-HNX-gE7TIT组小鼠健康 存活。
[0189] 4) 14 天后，DMEM 组和 PRV-HNX-gE_/TK_ 组，左大腿皮下注射 IO47TCID5tl 的 PRV-HNX。
[0190] 5)48~96h后，DMEM组小鼠发病死亡，PRV-HNX-gE7TIT组小鼠健康存活，如图10 所示