一个氨基酸。亦可利用 已知的固态肽合成法来合成本发明的合成肽。
[0068] 本发明的范围亦涵盖了其它相较于39-聚体具有保守性突变的合成肽。本文所用 术语"保守性突变"指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性突变的 例示包括疏水性残基（如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸与甲硫氨酸）彼此间的置换，或极性残 基（如精氨酸与赖氨酸；或谷氨酸与天冬氨酸，或谷氨酰胺与天冬酰胺）彼此间的置换等。 "保守性突变"在此亦指利用取代的氨基酸来取代未取代的原始氨基酸，只要针对该取代的 多肽产生的抗体也能与该未取代的多肽发生免疫反应即可。
[0069] 依据本发明多种实施例，所述的脱发可以是生长期脱发（如，由化疗或放疗所导 致的脱发）、休止期脱发（如，由压力、饮食不均衡、药物或感染所导致的脱发）或雄性秃。
[0070] 在某些实施例中，所述的毛发脱色是指由化疗或放疗所导致的毛发脱色。在另一 些实施例中，所述的毛发脱色是指由压力或老化所致的毛发脱色。
[0071] 根据本公开的一些实施例，所述对象可以是任何归类为哺乳动物的动物，包括人。
[0072] 亦可将上述实施方式所述的各种合成肽调制成局部给药的药物组合物，以治疗对 象脱发和/或毛发脱色；此药物组合物落入本发明其它方面的范围之内。
[0073] 根据本发明一实施方式，上述局部给药的药物组合物包含上述任一方面/实施例 的合成肽，且此合成肽的含量足以有效治疗对象的脱发和/或毛发脱色。此局部给药的药 物组合物还可包含用于该合成肽的药学上可接受的赋形剂。
[0074] 可根据既有的药学程序来制备上述药物组合物，譬如《雷明顿制药科学》 (Remington'sPharmaceuticalSciences)(第 17 版，AlfonosoR.Gennaro编，麦克出版 公司（MackPublishingCompany)，伊斯顿，宾夕法尼亚（1985)) -书中有详细的记载。
[0075] 在选择适用于投递合成肽的药学上可接受的赋形剂时，主要需考虑此局部给药的 药物组合物的给药方式。根据本发明的可任选实施例，可利用涂敷、涂抹、按摩或喷涂或其 它手段，使此局部给药的药学组合施用于对象的生物学表面（如，皮肤、头皮或头发），而使 得所述合成肽能够透过毛囊的主动吸收（即，经附体途径（transappendagealroute))或 通过跨细胞途径或细胞间途径的经皮形式而到达目标部位（如，毛囊）。
[0076] 可使用本领域周知的皮肤学上可接受的各种惰性赋形剂。典型的惰性赋形剂可以 是例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、矿物油、硬脂醇、软膏基质和形成胶状物的材料。
[0077] 可任选地，本发明的药物组合物亦可包含本领域周知的药学上（特别是皮肤 学上）可接受的添加剂。所述添加剂包括但不限于干燥剂、抗痒剂、抗发泡剂、缓冲剂、 中和剂、pH调节剂、着色剂、脱色剂、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、增黏剂（viscosity builders)、保湿剂、添味剂（odorants)、防腐剂、抗氧化剂、化学稳定剂、增稠剂、硬化剂、或 悬浮剂。
[0078] 依据本发明多种实施例，所述局部给药的药物组合物可调制成各种剂型，如溶液、 喷剂、气雾剂、泡沫、霜剂、洗剂、软膏、凝胶或敷料。
[0079] 根据本发明的可任选实施例，此药物组合物中所述合成肽的含量为约0. 1-100 1^;较佳为约1-25 1^。举例来说，合成肽的浓度可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.3、 0?7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95或100yM。具体而言，下文实施例中针对约20克重的小鼠所用的浓度为约25yM。 本发明所属技术领域具有通常知识者可基于本说明书提出的动物给药剂量计算出本发明 合成肽或药物组合物的人体等效剂量（HE?。譬如，美国食品暨卫生管理局已批准了工业 指南，题为"成年健康志愿者临床治疗实验中最大安全起始剂量的估算"（Estimatingthe MaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsinAdult HealthyVolunteers)〇
[0080] 可任选的，亦可将所述合成肽调制于一缓释剂型中，以确保该治疗可提供较长效 的治疗效果。譬如可先将所述的合成肽包裹于一载体中，而后再将其调制成所需的剂型。上 述载体如，脂质体、微球体或纳米体（nanosome)。于某些实施例中，这些可形成微泡的载体 (如，脂质体）亦可促进所述合成肽或药物组合物的投递速率。
[0081] 可任选的，可先将合成肽制成一包覆料，而后将其涂布、浸渍或以其它方式留置于 基材的表面上和/或孔隙中，以得到诸如敷料的制剂。基材可由至少一种天然材料、至少一 种合成材料或两者的组合制成。例如，天然材料可以是胶原蛋白、透明质酸、海藻酸盐或壳 聚糖，或其衍生物；合成材料可以是聚氨酯、聚乙醇酸或聚乙烯氢吡咯酮，或其衍生物。所述 的包覆料和/或基材可具有足够的生物黏着性，以利敷料附着于对象的生物性表面（如，头 皮），且于移除敷料时不至于对毛发生长造成负面影响。
[0082] 又一方面，本发明提出了一种治疗对象脱发和/或毛发脱色的方法。所述对象可 以是任何哺乳动物，包括人类。
[0083] 于一实施例中，上述方法包含给予对象有效量的根据上述方面/实施例的合成 肽。根据本发明多种实施例，所述合成肽可局部或全身给予。优选局部所述合成肽。于更 佳的实施方式中，可将所述合成肽局部给药至该患者的生物性表面（如皮肤、头皮或毛发） 上，而使得合成肽可到达目标部位（如，毛囊）以促进毛发生长和/或毛发染色。
[0084] 于可任选的实施例中，可将所述合成肽调制为上述方面/实施例所述的局部给药 的药物组合物。于一实施例中，可将本发明的药物组合物施用至对象的生物性表面（如皮 肤、头皮或毛发）上。
[0085] 此外，本公开实施例的合成肽或局部给予的药物组合物可在指定条件下给予（如 特定的湿度或温度）。譬如在较为温暖潮湿的条件下给药可促进合成肽在目标位置的吸收。
[0086] 依据本发明多种实施例，对象可能患有脱发，例如生长期脱发、休止期脱发或雄性 秃，其导致异常毛发损失。于某些实施例中，对象可能患有化疗、放疗、氧化压力或老化所致 的毛发脱色。此外，对象亦可能患有因其遗传组成而导致的脱发和/或毛发脱色。
[0087] 下文提出多个实施例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有 通常知识者实施本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人 员在阅读了本文的描述后，可完整利用本发明。本文所引用的所有公开文献，其全文均以引 用的方式纳入本文。 实施例
[0088] 材料与方法
[0089]〈材料〉
[0090]DMEM培养基、胎牛血清（FBS)与0.25 %胰蛋白酶皆购自英杰生命技术有限公司 (Invitrogen，加利福尼亚，卡尔斯巴德）。二氢睪酮（DHT)、乙醇、1-油酰基单甘油醋、轻质 矿物油、羟丙基甲基纤维素、二甲亚砜DMS0)、胰岛素、皮质醇皮质醇、牛血清白蛋白（BSA)、 5_溴_2' -脱氧尿苷（BrdU)、Hoechst33258染料与Hoechst33342染料皆购自西格玛奥 德里奇（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）。抗-BrdU抗体购自基泰（GeneTex，台北， 台湾）。抗c-kit抗体（No. 3074)购自细胞信号技术（CellSignalingTechnology)公司 (美国马萨诸塞，韦弗利）。抗酪氨酸酶抗体（No.sc-7833)和所有荧光染料偶联的二级抗体 均购自圣克鲁斯生物技术公司（SantaCruzBiotechnology，加利福尼亚，圣克鲁斯）。苏 木精与曙红（H&E)染料购自默克（美国新泽西州，雷威（Rayway))。
[0091] 合成FITC-结合的29-聚体与其它短合成PEDF肽（包括44-聚体（SEQIDN0:10)、 29-聚体（SEQIDNO:3)、24_ 聚体（SEQIDNO:5)、20_ 聚体（SEQIDNO:6)、18-聚体（SEQ IDNO:7)、与Mo20-聚体（SEQIDNO:9))，并将其N端乙酰化、C端酰胺化而进行修饰。然 后以质谱仪（金斯瑞，新泽西州皮斯卡塔市）表征修饰的肽（纯度>95% )。
[0092]〈动物〉
[0093] 本说明书所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度控制的饲养笼中，饲养温度 约24°C至25°C，光暗循环为12 :12小时。试验过程中提供饮水与标准实验室饲料供任食。 实验计划皆通过马偕纪念医院（新北市，台湾）伦理委员会核准，并遵循国家动物保护相关 规范。
[0094]〈软膏或凝胶配方〉
[0095] 以DMS0为溶剂，将每一PEDF衍生合成肽（以下简称PEDF肽包括FITC-结合的 29-聚体、44-聚体、29-聚体、24-聚体、20-聚体、18-聚体与Mo20-聚体）制成5mM的储 备溶液，并储存于_20°C中以供后续使用。
[0096] 使用前，将含有44-聚体的储备溶液稀释制成工作稀释液，并与抗生素软膏混合， 以得到含有25yM的44-聚体的抗生素软膏。上述抗生素软膏每克含有5毫克硫酸新霉素 以及12. 5毫克枯菌肽。至于其它PEDF肽则是将5y1的上述5mMPEDF肽储备溶液以乙醇 (30%w/w溶于蒸馏水中）逐渐溶解后，缓缓加入1% (w/w)的1-油酰基单甘油酯（一种皮 肤穿透促进剂）与1% (w/w)的轻矿物油；接着加入5% (w/w)的羟丙甲基纤维素（使最终 体积为1毫升，在加入羟丙甲基纤维素后，溶液开始发生胶化反应。另外制备对应于该肽制 剂的DMS0载体，用于体内对照。FITC-29-聚体也溶解在相同制剂中，施加到皮肤上，以观察 FITC-29-聚体于毛囊中的分布。
[0097] 欲进行局部给药时，将350mg含有25yMPEDF肽的软膏或凝胶轻轻地涂敷于每只 小鼠的背部皮肤。
[0098]〈组织学、免疫荧光与定量分析〉
[0099] 收集与脊椎线平行处的小鼠背部皮肤，以取得包含毛囊纵长范围的样本。背部皮 肤经4%甲醛固定后，以固态石蜡包埋，获得纵长切片。将组织切成约5-ym的薄片。于使 用前，于二甲苯中移除固定样品的石蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇使样品再水化。利用 H&E染色进行一般组织学观察。利用Zeiss荧光显微镜（德国，耶拿）由样本中的代表性区 域撷取数字显微照片（固定倍率：l〇〇X)。
[0100] 欲分析毛囊的组织形成过程，于脱毛后第15天将动物安乐死。根据本领域所接 受的鼠类毛囊组织形态学分类标准（参见 ：Miiller-R6ver等，皮肤病学杂志（Journalof InvestigativeDermatology) (2001) 117, 3 - 15)来评估在组织形成过程中处于不同阶段 的毛囊的百分比。分析由6-10只经DHT处理的小鼠取得的至少24个纵切毛囊切片。欲证 明经DHT处理的皮肤中PEDF肽依赖性退化期延迟，由单一代表性皮肤切片中选取5至7个 连续显微视野，而后利用计算机辅助的影像分析器（AdobePhotoshopCS310.0)将这些显 微视野合并。
[0101] 进行免疫染色分析前，将脱腊的组织切片以10%山羊血清处理约1小时以进行阻 断。之后以抗C-kit的一级抗体（稀释比1 :100,红色）以及抗酪氨酸酶抗体（稀释比1 : 100)在37°C下培育2小时，进行双重染色，再和与若丹明结合的山羊抗兔IgG抗体（稀释 比1 :500)于室温下培育1小时，之后用苏木精（蓝色）进行约7分钟的对比染色。
[0102] 小鼠触须毛囊的冷冻切片以PBS冲洗三次。经甲醛固定与石蜡包埋的样本于二甲 苯中移除石蜡，并以一系列浓度梯度的乙醇再水化。接着使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶 介导的缺口末端标记（TdT-mediateddUTPni