cry1Ia基因及应用、由其编码的Cry1Ia蛋白及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及crylla基因及其应用，由crylla基因的编 码的CrylIa蛋白和编码蛋白在寄生线虫防治上的应用。
【背景技术】
[0002] 植物寄生线虫病是农作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生线虫所造成的作 物损失超过千亿美元（Chiwold，2003)，线虫病害已成为农业生产上的一个突出问题。目前， 农业生产上常采用化学杀线虫剂来防治植物寄生线虫病害，但现今市场上杀线虫剂的品种 有限，大部分为高毒、高残留农药，长期单一地使用高毒、高残留的化学杀线虫剂，不仅对环 境造成了严重的污染，也引发了农产品中农药残留超标、线虫抗药性日益突出等系列环境 和社会问题。近年来，随着人们对农产品安全的日益关注，化学农药的使用越来越受到限 制，因此，研发有效的杀线虫微生物以补充或替代化学杀线虫剂就显得日益迫切。
[0003] 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用最 广泛、最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等领域的害虫防 治。自从1961年Ciordia等首次发现Bt对牛肠道蛇形毛圆线虫（thichostrongylus colubriformis)卵和幼虫有杀灭作用以来，Bt的杀线虫作用才逐渐引起人们的关 注。国内外已报道的具有杀线虫活性的Bt菌株主要包括Bt苏云金亚种（B.t.subsp. thuringiensis)、以色列亚种（Β· t. subsp. Israelensis)、库斯塔克亚种（Β· t. subsp. Kurstaki)和莫里斯亚种（B.t.subsp. Morris)。这些菌株对多种植物线虫具有生物活性， 如酸酱线虫（Panagrellus redivivus)、南方根结线虫（Meloidogyne incognita)、穿刺短 体线虫（Pratylenchus penetrans)和大豆抱囊线虫（Heterodera glycines)等（Schnepf， 1998)〇
[0004] 1985年Bone等首次证实了 Bt伴胞晶体蛋白（δ -内毒素）对线虫的作用活性， 2003年Wei等研宄了不同基因产生的伴胞晶体蛋白对几种自由生活线虫的毒性，从两个主 要的Β. t.晶体蛋白亚家族中表达出了 7种不同的晶体毒素蛋白，通过测试这些晶体毒素蛋 白对自由生活的线虫毒性，证实了其中4种晶体毒素蛋白（Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A) 对多种线虫种类均有活性，所测试的线虫至少对一种晶体毒素蛋白敏感，从而明确提出Bt 晶体毒素蛋白具有杀线虫能力（Wei JZ, 2003)。B.t.晶体毒素蛋白是由毒素蛋白基因 （cry 基因）编码的，不同苏云金芽胞杆菌亚种或菌株所具有的cry基因不同。1988年以来，美国 Mycogen公司分离到一些对秀丽新小杆线虫、短体线虫、捻转血矛线虫等有毒性的苏云金 芽胞杆菌，并从这些菌株中克隆了一些杀线虫毒素蛋白基因（参见http://appft. uspto. gov/netacgi)。到目前为止，全世界从B.t.菌株中已分离到的杀线虫基因主要有cryl、 cry5、cry6、cryl2、cryl3、cryl4以及cry21几大类，但数量十分有限，而且这些菌株、伴 胞晶体蛋白及伴胞晶体蛋白基因几乎都以专利的形式加以保护，所涉及的菌株也多使用代 号。因此，分离鉴定新的杀线虫Bt菌株与伴胞晶体蛋白引起国内外科学家的广泛重视。
[0005] cry I Ia基因是cry基因家族中非常特殊的cry 1类基因，最先由Tailor等 从B.thuringiensis菌株4835中克隆，该基因编码一个81KD的蛋白，对鳞翅目的夜蛾 科（Noctuidae)、卷叶蛾科（Tortricidae)、菜蛾科（Plutellidae)和鞘翅目的叶甲科 (Chrysomelidae)的害虫具有较好的杀灭效果。crylla基因在大都数Bt菌株中被沉默而没 有表达产物（(Kostichka et al, 1996)，其主要原因在cryll基因编码区上游一般与cryl 类基因相邻，称为cryl-cryll连锁，造成了 cryll基因自身启动子的缺乏。
[0006] 尽管crylla基因在Bt菌株中普遍被沉默，但已有多个基因被克隆，全球分离克隆 的crylla基因有13种。但是目前为止，克隆获得的crylla基因及表达蛋白的杀虫作用仅 限于鳞翅目和鞘翅目害虫，还没有crylla基因及表达产物对植物寄生线虫具有作用活性 的相关研宄报道。
[0007] 湖南省植物保护研宄所分离了一种苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis) 菌株YC-IO，并将其保藏至中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)，保藏单位地址位于中国 武汉大学，保藏日期2010年1月21日，保藏号为CCTCC NO :M 2010023。研宄发现苏云金 芽胞杆菌YC-10产生的伴胞晶体对植物寄生线虫具有较高的生物活性。然而，该菌株产生 的伴胞晶体蛋白是由多种成分组成的混合物，不仅未明确具体杀线虫活性蛋白，且蛋白产 量低，导致伴胞晶体抽提物在植物寄生线虫防治上很难广泛应用。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种从苏云金芽孢杆菌 中分离得到的crylla基因，该crylla基因可应用于杀线虫的防治；本发明还提供了由 crylla基因编码的CrylIa蛋白及其制备方法和应用，CrylIa蛋白使之表现出对植物寄生 线虫的毒性，具有高效、低毒、生态环保、且能有效减少农药残留等优势，可做为新型的生物 农药。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0010] 种crylla基因，优选的，所述crylla基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列。
[0011] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述crylla基因在防治寄生线虫 中的应用。
[0012] 上述的应用，优选的，将crylla基因转化植物，得到抗线虫植株的新品种。
[0013] 上述的应用，优选的，将crylla基因转化微生物，获得可高效表达用于防治线虫 的蛋白，表达的蛋白可制成生物农药用于防治植物线虫病害。
[0014] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述crylla基因编码的CrylIa蛋 白。
[0015] 上述的CrylIa蛋白，优选的，所述CrylIa蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示 的序列。
[0016] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的CrylIa蛋白的制备方法，其 特征在于，所述CrylIa蛋白的制备方法具体包括以下步骤：
[0017] S1、以SEQ ID NO. 3所示的序列和SEQ ID NO. 4所示的序列为引物，对所述crylla 基因进行PCR扩增得到扩增产物；
[0018] S2、将所述扩增产物与载体连接得到重组子；
[0019] S3、将所述重组子转化至大肠杆菌中得到转化子；
[0020] S4、将所述转化子进行活化、表达，得到CrylIa蛋白。
[0021] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S2中所述载体为pQE30。
[0022] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S4具体为：
[0023] S4-1、将所述转化子涂布于LB平板中，培养过夜得到培养液；
[0024] S4-2、将所述培养液接种于LB培养基中进行放大培养；
[0025] S4-3、加入诱导剂继续培养4~12h ;
[0026] S4-4、搜集所述步骤S4-3培养得到的菌体进行超声破碎、离心得到CrylIa蛋白。
[0027] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-1中所述LB平板中含有100 μ g/L的氨苄 青霉素。
[0028] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-2中将所述培养液方法培养至0D600为 0. 6 ~0. 7。
[0029] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-3中，所述诱导剂为异丙基-β -D-硫代半 乳糖苷。
[0030] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S4-3中，所述诱导剂的浓度为0. 5mM。
[0031] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的CrylIa蛋白或所述制备方 法制备得到的CrylIa蛋白在防治寄生线虫中的应用。
[0032] 上述的应用，优选的，所述寄生线虫为根结属线虫或孢囊属线虫。
[0033] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0034] (1)本发明提供了一种从苏云金芽胞杆菌YC-10分离得到的crylla基因，将 crylla基因转化植物或微生物，获得可高效表达用于防治线虫的蛋白，表达的蛋白可制成 生物农药用于防治植物线虫病害；还可以获得抗线虫植株的新品种，对线虫的防治效果好， 致死率高。
[0035] ⑵本发明提供了一种由crylla基因编码得到的CrylIa蛋白，20mg/L处理南方 根结线虫、大豆孢囊线虫J2,96h致死率达100%，不仅高效低毒，而且可以有效减少化学 农药的使用，降低化学农药对环境的污染，并能减少线虫抗药性的产生，进而有利于环境保 护，减少农产品上的农药残留，具有广阔的推广应用前景。
[0036] (3)本发明开拓了植物寄生线虫生物防治的新途径，扩大了适用于植物寄生线虫 的生物农药资源。
【附图说明】
[0037] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0038] 图1苏云金芽孢杆菌YC-10形态特征图。
[0039] 图2为本发明实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，M为DNA Marker， ck为阴性对照。
[0040] 图3为本发明实施例2中pQE30-cry