亲和素修饰的磁珠用磁珠清洗溶液重复清洗四次后定容至ImL ; 其次，将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNA 1混合，具体结合比例为：lmL， IOmg. ι?Γ1的磁珠对应lmL，5nM的DNA 1，反应条件为25°C，150转摇床2小时。反应结束 后，用磁珠清洗溶液重复清洗结合DNA探针的磁珠四次并将其最终定容到ImL反应缓冲溶 液中即得到基于磁性微球-寡聚核苷酸捕获探针溶液，于4°C保存以备使用。
[0037] 3)溶菌酶-DNA2信号探针准备实验
[0038] 首先，溶菌酶溶液与sulf〇-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基 琥珀酰亚胺酯钠盐）按8:1的质量比混合，涡旋5分钟后与室温孵育一个小时，反应产物 用bufferA超滤八次；对于DNA活化，取巯基修饰的信号探针DNA2链与二硫苏糖醇溶液按 照1:10的质量比混合，室温反应2小时，反应产物用buffer A超滤八次以出去多余的DTT ; 将上述得到的两种产物混合，并于室温下孵育48小时后再次用buff erA超滤八次以除去 未结合的溶菌酶即得到基于溶菌酶-DNA信号探针。将得到的产物于4°C保存以备使用。
[0039] 其中，二硫苏糖醇溶液为二硫苏糖醇溶解于磷酸盐缓冲溶液（0. 1Μ，ρΗ8.0)中，浓 度为125mM ;
[0040] 溶菌酶溶液为溶菌酶溶解于缓冲液中，浓度为10mg/mL，缓冲液为0.1 M NaCl，0.1 M 磷酸盐缓冲溶液，pH 5. 0 ;
[0041] buffer A 为 0· IM NaCl, 0· IM 磷酸盐缓冲溶液，pH 7. 4。
[0042] 4)对食氨酸脱硫弧菌特异性DNA片段的检测实验
[0043] 10 μ L磁性微球-捕获探针DNA1，10 μ L溶菌酶-DNA2信号探针，及不同浓度食氨 酸脱硫弧菌特异性DNA片段10 μ L混合，于37°C摇床孵育30分钟；将孵育后得到的溶液 再加入溶菌酶显色底物（4-Nitrophenyl0-D_N，N'，N" -triacetylchitotriose)混合， 于40°C，40mM磷酸盐缓冲溶液（pH 5. 0)条件下反应15小时后加入2ml硼酸盐缓冲液pH 9. 3,观察对反应后的溶液溶液颜色由无色变为淡黄色，由此对样品中SRB的定性及半定量 检测（参见图3)。
[0044] 由图 3可得，样 a-样 h 依次为不同浓度（(a)lX108,（b) :1X107,（c) :1X106,（d) :I X 105,（e) : I X 104,（f) : I X 103,（g) : I X 102CFU/mL，（h) :Blank)的 SRB 提取的 DNA 片段检 测的显色图。空白样显示为无色，与之对比，样品a显示为亮黄色，由此可断定SRB的存在， 并对其进行定性检测。同时，随着菌种浓度的减小，溶液颜色逐渐变淡，样品f仍具有微弱 的淡黄色，与空白样对比明显，由此认为肉眼观察的最低浓度为IX IO3CFUAiL的SRB样品。
[0045] 由于肉眼观察颜色辨识因人而异且颜色受温度、实验条件等的影响，可导致最低 检测浓度的微量变化。另外，肉眼观察仅限于不同数量级浓度之间的检测，对于精确浓度的 菌种检测仍存在一定的限制。由此可认为对SRB的半定量检测。
【主权项】
1. 一种通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其特征在于：利用基于 溶菌酶-DNA信号探针，磁性微球-捕获探针对SRB特异性DNA片段进行检测，通过观察反 应前后溶液颜色的变化，实现SRB的定性及半定量检测。2. 按权利要求1所述的通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其特征 在于：磁性微球-捕获探针DNA1，溶菌酶-DNA2信号探针，及不同浓度SRB特异性DNA片 段按1:1:1的体积比混合，于37-40°C摇床孵育30-60分钟；向孵育后得到的溶液中加入 溶菌酶显色底物混合，于40-50°C，40mM磷酸盐缓冲溶液（pH 5.0)条件下反应10-15小时 后加入硼酸盐缓冲液PH 9. 3终止反应，观察对反应后的溶液溶液颜色由无色变为淡黄色， 由此对样品中SRB的定性及半定量检测。3. 按权利要求2所述的通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其特征 在于：所述溶菌酶-DNA2信号探针为溶菌酶与DNA2信号探针杂交获得；所述磁性微球-捕 获探针DNAl为将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNAl杂交获得。4. 按权利要求3所述的通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其特征 在于：所述磁性微球-捕获探针DNAl与目标检测物DNA链部分片段结合形成双链，目标检 测物DNA单链未结合部分与溶菌酶-DNA2信号探针结合。5. 按权利要求2所述的通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其特征 在于： 所述基于溶菌酶-DNA2信号探针为取溶菌酶溶液与4-(N-马来酰亚胺甲基）环己 烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC)按8:1的质量比混合，涡旋5-10分钟 后与室温孵育1-2个小时，反应产物用bufferA超滤6-10次，得溶液A待用； DNA活化，取巯基修饰的信号探针DNA2链与二硫苏糖醇溶液按照1:10-1:100的质量比 混合，并在室温反应2-3小时，反应产物再用bufferA超滤6-10次，以出去多余的DTT ; 将上述溶液A与活化的DNA按照1:1的体积比混合，并于室温下孵育36-48小时后再 次用bufferA超滤6-10次，去除未结合的溶菌酶即得到基于溶菌酶-DNA信号探针，于4°C 保存以备使用； 其中，二硫苏糖醇溶液为二硫苏糖醇溶解于磷酸盐缓冲溶液（0. lM，pH8.0)中，浓度为 125mM ； 溶菌酶溶液为溶菌酶溶解于缓冲液中，浓度为10mg/mL，缓冲液为0.1 M NaCl，0.1 M磷 酸盐缓冲溶液，pH 5. 0 ; buffer A 为 0.1 M NaCl, 0.1 M 磷酸盐缓冲溶液，pH 7. 4。6. 按权利要求2所述的通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其特征 在于： 所述硫酸盐还原菌为对SRB种群在25-40°C，隔绝空气条件下进行富集，然后将SRB进 行清洗并利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA ; 以利用SRB特异性引物对上述提取的细菌基因组DNA进行聚合酶链式反应（PCR)扩增 得到特异性DNA片段。7. 按权利要求6所述的通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，其 特征在于：所述聚合酶链式反应用量为模板DNA，5. 0-6. 0 y L ;超纯水，10. 0-16. 0 y L ; 聚合酶缓冲溶液，L 0-3. OyL;三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs)，0? 5-1. 0 y L ;上游引 物，I. 0-2. O y L ;下游引物，0. 5-2. O y L ;耐热DNA聚合酶，0. 2-0. 5 y L ;或所述上下游引物 的用量相反； 反应条件为：复制起始（94°C，5-10min) ;35个循环变性（94°C，30-60s)，退火处理 (55°C，30-60s),延伸（94°C，30-60s);终止（72°C，7-10min)。
【专利摘要】本发明涉及到硫酸盐还原菌(SRB)的检测，具体为一种通过肉眼观察对SRB进行半定量检测的方法。利用基于溶菌酶-DNA信号探针，磁性微球-捕获探针对SRB特异性DNA片段进行检测，通过观察反应前后溶液颜色的变化，实现SRB的定性及半定量检测。本发明基于此信号对硫酸盐还原菌进行检测，与传统检测方法相比，该方法不需要特定的检测仪器，方法特异性强，只需利用肉眼观测溶液信号的变化即可对SRB进行定性及半定量检测，具有很好的现场应用前景。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN104946752
【申请号】CN201510303818
【发明人】曾艳, 张盾
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月4日