和时间；排泄速率和清 除率；药物组合；及特定病状的严重程度。
[0041] 本发明的药物组合物可以单独使用，或与可用于治疗心肌缺血再灌注损伤的其它 适合的治疗剂组合使用。或者与其他治疗心肌缺血损伤手术方法一起使用。
[0042] 本发明所述的"治疗"包括对病症的彻底治愈，还包括对病症的缓解。
[0043] 本发明所述的"ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用"表示TABl与ρ38 α相结合和/或TABl介 导ρ38α的自身磷酸化。
[0044] 本发明所述的"ΤΑΒ1/ρ38α相互作用导致的疾病"表示该疾病的发生与TABl/ ρ38 α相互作用相关，ΤΑΒ1/ρ38相互作用是疾病发生的一个因素或者全部因素。
[0045] ΤΑΒ1/ρ38α相互作用导致的疾病包括但不限于心肌缺血再灌注损伤。
[0046] 本发明的优点和有益效果：
[0047] 本发明首次发现了 ρ38 α拮抗肽突变体ΡΤ5-2,其序列如SEQ ID NO. 4所示，与ΡΤ5 相比，该突变体对于ΤΑΒ1/ρ38α的结合抑制能力更强，且对TABl介导的ρ38α自身磷酸化 抑制能力更强。
【附图说明】
[0048] 图1显示pGEX-KG-TABl和pET-32a_p38 α质粒双酶切鉴定图；
[0049] 图2显示GST-TABl融合蛋白考马斯亮蓝染色图；
[0050] 图3显示His_p38 α融合蛋白考马斯亮蓝染色图；
[0051] 图4显示利用GST-pull down和免疫印迹研宄ΡΤ5突变体对ΤΑΒ1/ρ38α结合的 影响；
[0052] 图5显示图4所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图；
[0053] 图6显示利用GST-pull down和免疫印迹研宄ΡΤ5突变体对ΜΚΚ6/ρ38α结合的 影响；
[0054] 图7显示图6所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图；
[0055] 图8显示利用体外激酶活性分析和免疫印迹研宄TABl蛋白对ρ38 α磷酸化的影 响；
[0056] 图9显示利用体外激酶活性分析和免疫印迹研宄ΡΤ5突变体对TABl介导的ρ38 α 自我磷酸化的影响；
[0057] 图10显示图9所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图；
[0058] 图11显示体外激酶活性分析和免疫印迹研宄ΡΤ5突变体对ΜΚΚ6介导的ρ38 α磷 酸化的影响；
[0059] 图12显示图11所示的免疫印迹实验结果的半定量分析图。
【具体实施方式】
[0060] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域 熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用 于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0061] 实施例1 pGEX-KG-TABl和pET-32a_p38 α原核表达载体的构建
[0062] 1、方法
[0063] I. ICaCl2法制备菌株JM109感受态
[0064] (1)将菌株JM109 (军事医学科学院基础研宄所分子免疫室保存）涂布在无抗LB 平板上，37°C培养过夜，以活化菌株；
[0065] (2)从LB平板上挑取单菌落接种于5ml LB培养基中，37°C培养过夜，按I :100~ 1 :50的比例接种于100mL无抗LB培养液中，37°C振荡2~3h至OD6ticinm^ 0. 5 ;
[0066] (3)将培养液转入离心管中，冰上放置lOmin，离心10min以收集菌液；
[0067] (4)弃上清，用高压预冷的0· 05mol/L的CaCl2溶液IOml轻轻悬浮菌株，冰上放置 15 ~30min 后，4°C，4000rpm 离心 IOmin ;
[0068] (5)弃上清，加入41111预冷的含15%甘油的0.05111〇1/1的0 &(：12溶液，轻轻悬浮菌 株，冰上放置5min后，100 μ 1/管分装，-70°C可保存半年。
[0069] 1.2引物的设计合成
[0070] pET-32a载体带有6 X His标签和硫氧环蛋白的编码序列，pGEX-KG载体5'端带有 编码GST蛋白的序列，便于用于蛋白的纯化和检测。根据美国国家生物技术信息（National Center of Biotechnology Information，NCBI)网站基因文库中 TABl 和 ρ38α 的序列，自 行设计带有酶切位点的5'端和3'端的寡核苷酸引物，以扩增DNA片段。TABl上游引物序 列如SEQ ID NO. 9所示，TABl下游引物序列如SEQ ID NO. 10所示，ρ38 α上游引物序列如 SEQ ID NO. 11所示，ρ38 α下游引物序列如SEQ ID NO. 12所示，引物设计信息见表1。
[0071] 表1引物设计
[0072]
[0073] I. 3pGEX-KG_TABl 和 pET-32a_p38 α 重组质粒的构建
[0074] (I) TABl 和 ρ38 a DNA 片段的扩增
[0075] 以 pCDNA3. I (+) -XPRESS-TAB1 和 pCDNA3. I (+) -FLAG-p38 α 质粒为模版进行 PCR(质粒来源参考博士毕业论文《接头蛋白TABl和GNB2L1调节ρ38 α的结构基础》作者： 王庆阳第36-38页）。
[0076] PCR 反应体系（总体积为 30 μ 1):模版 1 μ I ;2 X Taq MasterMix 酶 15 μ 1 ;5' 端 引物（10μΜ)1μ1 ;3' 端引物（10μΜ)1μ1 ;DMS0 0·5μ1 ;去离子水 11·5μ1。
[0077] PCR反应条件：①95°C预变性5min ;②94°C变性30s ;③58°C退火45s ;④72°C延 伸L 5min ;⑤到②循环25次；⑥72°C 5min。
[0078] (2)琼脂糖凝胶电泳的分离与回收
[0079] 配制1. 2%的琼脂糖凝胶，将全部？〇?产物和01^200011^1?51'加入孔道中，20011^恒 流分离目的条带，当Taq酶中的溴酚蓝迀移至足够分离DNA片段的距离时，在紫外灯（波长 310nm)下观察，并切下目的条带，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自TIANGEN公司）说明 书操作步骤回收目的DNA片段。
[0080] (3)将PCR扩增的目的片段和载体分别进行双酶切
[0081] 酶切体系为：
[0082] 胶回收片段（总体积为 2〇 μ I) :10XCutsmart Buffer 2 μ I ;BamH I / Xba I 1 μ I ;HindIII 1 μ I ;胶回收片段 16 μ I ;100XBSA0. 2 μ I ;
[0083] 载体（总体积为 20 μ I) :10XCutsmart Buffer 2 μ l、BamH I /Xba I I μ I ;Hind ΙΙΙΙμΙ ;载体2μ1 ;100XBSA0.2yl ;去离子水 14μ1〇
[0084] 37 °C水浴过夜。
[0085] (4)回收有粘性末端的目的片段和载体片段
[0086] 加入4 μ I 6 X Loading Buffer (购自TIANGEN公司），琼脂糖凝胶电泳获得目的基 因片段。方法同前所述。
[0087] (5) ΤΑΒ1/ρ38 α目的片段与pGEX-KG/pET_32a载体片段连接
[0088] 反应体系（总体积15 μ 1):目的片段11. 5 μ 1 ;载体1. 5 μ I ;T4连接酶缓冲液 1. 5 μ 1 ;Τ4 连接酶 1 μ 1 ;
[0089] 16。〇反应211。
[0090] (6)转化
[0091] I)LB固体培养皿（含氨苄）放37°C孵箱中预热；
[0092] 2)从-70°C冰箱中取出4管JM109感受态菌株，迅速插入冰中；
[0093] 3)吸取10 μ 1连接体系加入100 μ 1感受态中，轻轻吹打混匀；
[0094] 4)冰上放置30min，同时调水浴锅至42°C ;
[0095] 5)42°C水浴锅中热休克90s，然后立即置冰上冷却2min ;
[0096] 6)每管中加入500 μ1无抗的LB液体培养基，37°C摇床上震荡45min，转速 150rpm ；
[0097] 7)6000rpm离心lmin，弃部分上清，剩余约100 μ I LB，重悬细菌，混勾后均勾涂布 在含氨苄的LB固体培养基上。待液体被吸收后，将平皿倒置放入37°C孵箱中过夜培养；
[0098] (7)菌落PCR鉴定
[0099] 挑取单克隆菌落，至5ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37°C过夜培养。过夜 培养的菌液取出50 μ 1，离心后去上清，生理盐水100 μ 1重悬，沸水煮lOmin，离心后取2 μ 1 作为模板进行PCR，进行PCR鉴定，PCR条件和步骤同前所述。
[0100] 反应体系为：
[0101] 菌液上清 2μ1 ;2XTaq MasterMix 酶 10μ1 ;5' 端引物（10μΜ)1μ1 ;3' 端引物 (10 μ Μ) 1 μ I ;DMS0 0· 5 μ 1 ;去离子水 5. 5 μ 1 〇
[0102] (8)选取3个阳性克隆送公司测序。
[0103] 挑取阳性克隆送北京天一辉远公司测序。
[0104] 1.4 重组 pGEX-KG-TABl 和 pET-32a_p38a 质粒的扩增
[0105] 对测序正确的质粒按无内毒素质粒中提试剂盒说明书（购自康为世纪公司）的步 骤中提质粒，用于下一步的实验。
[0106] 2、结果
[0107] 2.1双酶切鉴定
[0108] pGEX-KG-TABl和pET-32a-p38a质粒分别用XbaI/Hindm和BamH/Hindm